RAC1 5′ UTR 의 구조적·기능적 특성에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

mRNA의 5′ untranslated region (5′UTR)은 translation 효율, mRNA stability, 그리고 세포 내 위치 조절에 관여하는 핵심적인 조절 구간이다. 5′UTR의 염기서열 길이와 구조적 복잡성은 ribosome이 5′ cap 구조를 인식한 뒤 start codon으로 이동하는 scanning 과정에서 물리적 장벽으로 작용하거나, 특정 RNA binding protein(RBP)과의 상호작용을 매개함으로써, translation initiation complex의 조립 효율과 initiation site 선택성에 직접적인 영향을 미친다. 일반적으로 복잡한 이차 구조나 RNA G-quadruplex와 같은 구조 요소는 ribosome 접근을 방해하여 translation을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나 최근 연구에서는 일부 5′UTR이 구조적 복잡성을 가졌음에도 불구하고 translation을 촉진하거나, 세포 내 단백질 발현의 공간적 패턴을 조절할 수 있음이 제시되고 있다. 그러므로 본 연구는 안정한 구조를 가진 5′UTR이 단순한 억제 요소를 넘어 능동적인 translation 조절자로 작용할 가능성을 탐구하였다. 본 연구에서는 세포 성장과 극성 형성, 세포골격 재편성에 관여하는 small GTPase인 RAC1의 5′UTR은 복잡한 구조를 가짐에도 불구하고 예외적으로 강한 translation 촉진 효과를 나타내는 것으로 확인하였다. RAC1 5′UTR은 높은 GC 함량과 안정적인 stem-loop, G-quadruplex 구조를 포함한다. 이러한 복잡한 구조가 전반적인 translation 억제를 유도하지 않고, 구조와 서열 요소가 조합적으로 작용해 translation을 조절한다. 이를 검증한 fragment·mutation 분석에서도 핵심 조절 부위가 존재함이 드러났다. 또한 RAC1 5′UTR은 mRNA의 위치를 세포 말단으로 이동을 유도한다. 또한 EGF 처리에 의해서 RAC1 단백질의 protrusive membrane 재배치와 활성형(GTP-bound) RAC1의 활성 증가로 이어지는 기능적 변화를 동반하였다. 따라서 5′UTR에 의해 유도된 mRNA의 공간적 배치와 단백질 발현 증가가 결합하여, 세포 외 자극에 대한 RAC1 활성화 반응의 효율을 높이는 것으로 해석된다. 그러므로, 본 연구는 RAC1 5′UTR이 복잡한 구조를 지니면서도 translation 효율, mRNA stability, 세포 내 위치, 단백질 활성화까지 아우르는 다층적 translation 조절 기능을 수행함을 보여준다. 이는 5′UTR의 구조적 복잡성이 곧 translation 억제를 의미한다는 기존 모델을 확장하여, RNA 구조가 공간적·기능적 수준에서 단백질 발현을 조율하는 새로운 메커니즘을 제공할 수 있음을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 실험 재료 및 실험방법 5
• 1. Clone 제작 5
• 1-1 pcDNA 3.1(+) RAC1 cloning 5
• 1-2 pcDNA 3.1(+) 5'UTR 3XFLAG RAC1 cloning 5
• 1-3 pcDNA 3.1(+) 3XFLAG RAC1 cloning 6
• 1-4 pcDNA 3.1(+) 5'UTR 3XFLAG RAC1 mCherry cloning 6
• 1-5 pcDNA 3.1(+) 3XFLAG RAC1 mCherry cloning 6
• 1-6 pcDNA 3.1(+) Fragment 5'UTR 3XFLAG RAC1 mCherry cloning 7
• 1-7 pcDNA 3.1(+) Deletion and Site-Directed Mutagenesis of the RAC1 5'UTR cloning 7
• 1-8 pGL3 Firefly luciferase reporter cloning 7
• 2. 세포배양 8
• 3. Transfection 8
• 4. Total RNA isolation 과 RT-PCR, RT-qPCR 8
• 5. Luciferase assay 8
• 6. Immunofluorescence (IF) 9
• 7. Tyrimide-amplified Fluorescence in situ hybridization (FISH) 9
• 8. Western blot analysis 9
• 9. GTP-bound GTPase pull down assay 10
• 10. GEPIA2 분석 10
• Ⅲ. 결과 15
• Ⅳ. Figures 25
• Ⅴ. 결론 및 고찰 52
• Ⅵ. 참고문헌 54
• 외국어초록 60