qPCR을 이용한 Neisseria gonorrhoeae의 분자 진단 및 정량적 분석

국문 초록 (Abstract)

임균은 전 세계적으로 감염률이 증가하고 있는 주요 성 매개 감염증 중 하나로, 최근 무증상 감염과 항생제 내성균의 확산이 증가하는 추세이다. 이러한 임균 감염을 판정하기 위해선 임상적 검사가 수행되고 있으나 진단까지 소요 되는 시간이 길다는 단점이 있다. 따라서 임균에 의한 전파를 예방하기 위해선 임균에 대하여 특이도 높고 신속한 진단이 필요하다. 본 연구는 임균을 특이적으로 검출하기 위하여 TaqMan 프로브를 이용한 qPCR 기반 분자 진단법을 개발하고. 보다 빠르고 정확한 총균수 정량 분석법 개발에 목적이 있다. 임균의 주요 항원인 PI.A을 발현시키는 porA를 타겟으로 올리고 세트를 제작한 후, 이를 대상으로 특이도 및 민감도를 평가하였다. 또한 qPCR을 이용하여 표준균주와 임상 시료에 대한 평가를 수행하여 각 대상에 대한 임균 검출법을 평가하였다. 그 결과, porA 타겟 올리고 세트가 임균 외 병원체와 교차반응 없이 높은 특이도를 보였으며 1.0×10-4 ng/μL까지의 민감도를 확인하였다. 해당 올리고를 이용하여 2-step qPCR로 조건을 최적화하였으며, 총 17개의 임상 시료에 대한 평가 또한 모두 검출에 성공하였다. 평가된 임균 검출법을 적용하여 정량 표준물질로 검정곡선을 작성하여 배양된 임균에 대한 절대 정량을 진행하였다. 절대 정량 평가 결과, 배양법 기반의 총균수 측정 결과와 높은 일치율을 보였다. 그러므로 개발된 qPCR 기반 임균 검출법이 분자 진단 및 절대 정량법에 적용 가능하며, 임질 진단 시간 단축 및 진단 검사 발전에 기여할 수 있을 것으로 판단된다. 더 나아가 향후 항생제 내성균 스크리닝, 임질 감염 추적과 같은 역학조사까지도 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 11
• 2.1 시료 수집 11
• 2.2 임균 표준균주 및 참조 균주 배양 13
• 2.2.1 균주 배양 13
• 2.2.2 형태학적생화학적 특성 기반 미생물 동정 16
• 2.2.3 총균수 측정 18
• 2.3 표준균주 및 참조 균주 DNA 추출 20
• 2.4 임균 검출을 위한 올리고 제작 21
• 2.5 임균 검출을 위한 올리고 테스트 23
• 2.5.1 임균 검출용 프라이머 테스트 23
• 2.5.2 임균 검출용 프로브 테스트 26
• 2.6 임상 시료 기반 임균 검출법 평가 29
• 2.6.1 임상 검체 gDNA 추출 29
• 2.6.2 임상 시료 기반 임균 검출법 평가 29
• 2.7 qPCR 기반 임균 검출법 평가 및 총균수 절대 정량 30
• 2.7.1 qPCR을 이용한 임균 검출법 평가 30
• 2.7.2 표준균주 기반 총균수 절대 정량 30
• Ⅲ. 결과 31
• 3.1 임균 배양 및 미생물 동정, 총균수 측정 31
• 3.2 임균 검출을 위한 올리고 테스트 34
• 3.2.1 Conventional PCR을 이용한 프라이머 테스트 34
• 3.2.2 프라이머 특이도 및 검출 민감도 테스트 34
• 3.2.3 표준균주 기반 임균 검출법 평가 34
• 3.2.4 qPCR을 이용한 TaqMan 프로브 테스트 39
• 3.2.5 2-step qPCR을 이용한 임균 검출법 조건 최적화 45
• 3.2.6 TaqMan 프로브 특이도 및 검출 민감도 테스트 48
• 3.3 임상 시료 기반 임균 검출법 평가 51
• 3.4 qPCR 기반 임균 검출법 평가 및 총균수 절대 정량 54
• 3.4.1 임균 검출법을 이용한 표준물질 기반 결과 비교 54
• 3.4.2 표준균주 기반 총균수 절대 정량 평가 56
• Ⅳ. 논의 64
• Ⅴ. 결론 66
• 참고문헌 67
• 외국어초록 75