Exploring Competitive Relationship Between Haemophilus parainfluenzae and Mitis Streptococci via Co-Culture-Based Molecular Diagnosis and Metabolomic Assay

국문 초록 (Abstract)

Haemophilus, Actinomyces, Neisseria와 같은 질산염 환원 균주는 일산화질소와 암모늄 이온의 생산을 촉진시켜 구강 내 pH를 조절하며 산내성 세균의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나 타액 마이크로바이옴 내에서 다양한 세균 간 네트워크에 대한 실험적 증거는 불충분한 상황이다. 따라서 본 연구에서는 타액 마이크로바이옴의 주요 초기 집락자인 mitis Streptococci와 질산염 환원 균주인 Haemophilus parainfluenzae의 공동 배양 분석을 통해 치아 우식증 환자에서 관찰되는 잠재적 세균 경쟁 네트워크를 규명하고자 하였다. qRT-PCR 방법을 사용하여 공동 배양 시간에 따른 박테리아 성장 효율 변화를 확인하였으며, 또한 대사체학적 관점에서 구강 세균 간 대사적 상호작용 및 치아우식과의 연관성을 확인하기 위해 LC/Q-TOF 기반 대사산물 스크리닝을 적용했다. 그 결과, H. parainfluenzae는 mitis Streptococci와의 공동배양 환경에서도 질산염 환원 능력을 유지하는 것으로 나타났으나, 단독배양 대비 환원 효율이 감소하였다. 이어서 제작한 species-specific primer를 이용한 qRT-PCR 분석을 통해 H. parainfluenzae와 두 종의 mitis Streptococci (S. australis, S. sanguinis) 사이의 경쟁 관계가 존재함을 확인하였다. 또한 질산염 환원이 경쟁에 직접적으로 영향을 미친다는 근거는 확인되지 않았으나, LC/Q-TOF 기반 대사체 분석을 통해 mitis Streptococci가 생산하는 다양한 대사산물이 균주 간 상호경쟁을 유도할 가능성을 확인하였다. 특히, 타액 미생물군집 내에서 H. parainfluenzae 와 mitis Streptococci간 대사 네트워크를 이해하기 위한 참조 가능한 대사체 데이터를 구축함으로써, 해당 분야의 연구 부족 문제를 보완하고자 하였다. 본 연구의 결과는 향후 구강 건강과 관련된 메타게놈 및 메타볼로믹스 기반 연구에서 유용하게 활용될 수 있는 기초 자료로서의 잠재적 가치를 가진다고 판단된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Various bacterial strains with nitrate-reducing capacity (NRC), such as Haemophilus, Actinomyces, and Neisseria, are known to promote NH3 production, control pH in the oral cavity, and inhibit the growth of aciduric bacteria. However, experimental evidence on various estimated bacterial networks within the salivary microbiome is insufficient. This study aims to explore potential bacterial compositional competition observed within saliva samples from dental caries patients through a co-culture assay of mitis Streptococci, which is a primary colonizer in the salivary microbiome, and nitrate-reducing bacteria Haemophilus parainfluenzae. We investigated bacterial growth efficiency change by co-culture time using the qRT-PCR method. In addition, we applied LC/Q-TOF-based metabolites screening to confirm metabolic interactions between oral bacterial species and their association with dental caries from a metabolomics perspective. As a result, we first found that the nitrate reduction ability of H. parainfluenzae is maintained even in a co-culture environment with the mitis Streptococci group through a nitrate reduction test. However, nitrate reduction efficiency was hindered when compared with monoculture-based nitrate reduction test results. Next, we designed species-specific primers, and we confirmed by qRT-PCR that there is an obvious competitive relationship in growth efficiency between H. parainfluenzae and two mitis Streptococci (S. australis and S. sanguinis). Furthermore, although direct effects of nitrate reduction on competition have not been identified, we have potentially confirmed through LC/Q-TOF-based metabolite screening analysis that the interaction of various metabolic compounds synthesized from mitis Streptococci is driving inter-strain competition. In particular, we constructed a basic reference core-metabolites list to understand the metabolic network between each target bacterial species (H. parainfluenzae and mitis Streptococci) within the salivary microbiome, which still lacks accumulated research data. Ultimately, we suggest that our data have potential value to be referenced in further metagenomics and metabolomics-based studies related to oral health care.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and Methods 4
• Ⅲ. Results 12
• Ⅳ. Discussion 35
• V. Supplements 38
• VI. Supplements 39
• VII. References 40
• Korean Abstract 44