Efficacy of postbiotics derived from Lactiplantibacillus plantarum against Candida albicans hyphal biofilm on denture base fabricated by using various methods

국문 초록 (Abstract)

연구 목적
본 연구의 목적은 항진균제 내성 Candida albicans가 세 가지 의치상 재료(열중합 레진, CAD-CAM 밀링 PMMA, 3D 프린팅 메타크릴레이트 레진) 표면에서 형성한 균사형 바이오필름에 대해 Lactiplantibacillus plantarum 유래 무세포 상층액(cell-free supernatant)의 항칸디다 활성을 규명하고, CFS의 산도를 모사한 인공타액 환경에서 의치상의 표면 조도와 색 안정성에 미치는 영향을 분석함으로써 postbiotics 기반 전략이 기존 항진균 치료의 보조 또는 대체 요법이 될 잠재력에 대한 실험적 근거를 제공하는 데 있다.

서론
구강 칸디다증은 Candida albicans(C. albicans)에 의해 주로 발생하며, 임상에서 면역저하자와 고령 의치 착용자에서 빈번하게 나타나는 대표적인 기회감염이다. 기존 항진균 치료는 약제 내성의 증가, 치료 실패, 그리고 균사형 C. albicans가 형성하는 생물막의 높은 내성으로 인해 치료 효과가 점차 제한되고 있다. 마이크로바이옴 조절을 기반으로 한 새로운 접근법으로, 포스트바이오틱에 해당하는 Lactiplantibacillus plantarum (L. plantarum) 유래 세포상층액(cell-free supernatant, CFS)은 구강 병원균에 대한 항균 활성이 보고되었으나, 항진균제 내성 C. albicans 생물막에 대한 효과는 아직 충분히 규명되지 않았다. 또한 열중합, CAD-CAM 밀링, 3차원 프린팅 등 서로 다른 제작 방법으로 제조된 의치상 재료는 표면 조도와 습윤성 등 표면 특성이 상이하여 미생물 부착 양상에 영향을 줄 수 있으나, 이러한 의치상 표면 특성과 프로바이오틱 유래 항진균 효과 간의 상호작용은 명확히 밝혀지지 않았다. 따라서 L. plantarum 세포상층액의 항진균 효과와 의치상 재료에 미치는 영향을 평가하여, 의치 관련 칸디다증에 대한 임상 적용 가능성을 검증하는 추가 연구가 필요하다.

연구 재료 및 방법
세 종류의 의치상 재료, 즉 열중합 PMMA(SR Triplex Hot, H), 3D 프린팅 레진(New Base, P), CAD/CAM 밀링 PMMA(Ivotion base, M)로 제작한 원판 시편(20 mm × 3mm)을 연마하였다. 항진균제 내성 C. albicans 균주(암포테리신 B, 플루코나졸, 니스타틴 내성주)를 생성하였으며, 각 시편 위에 C. albicans의 균사형 바이오필름을 형성시켰다. 이후 L. plantarum 무세포 상층액(CFS)을 10, 30, 60분 동안 처리하였다. 항진균 효과는 집락형성단위(CFU) 계수와 Live/Dead 형광 염색을 통해 평가하였다. 공초점 레이저 주사현미경(CLSM)을 사용하여 표면 조도(Ra, Rq, Sa, Sq)를 침적 전과 4주 후의 표면 변화를 분석하였다. 색 안정성은 CIE Lab* 색도값을 이용하여 분석하였으며, 1, 2, 4주 침적 후의 색차(ΔE*, SCE)를 측정하였다.

연구 결과
L. plantarum CFS는 항진균제 내성 C. albicans 생물막의 생존세포 수를 시간에 따라 유의하게 감소시켰으며, 30분과 60분에서 통계적으로 유의한 감소가 확인되었다 (p < 0.05). 항진균 효과는 재료에 따라 차이를 보여 열중합 재료에서 가장 크고, 밀링 재료에서 중간, 3D 프린팅 재료에서 가장 낮았다. 4주 동안 중성 또는 산성 인공 타액에 침적한 결과, 표면 조도(Ra, Rq, Sa, Sq)에는 유의한 변화가 없었으며, 모든 ΔE* 값이 임상적 인지 임계 값(ΔE* <3.3) 이하로 유지되어 임상적으로 의미 있는 색 변화는 관찰되지 않았다.

결론
L. plantarum의 무세포 상층액(CFS)에 포함된 postbiotic 성분의 활성은 열중합, 밀링, 3D 프린팅 의치상 시편 위에 형성된 항진균제 내성 C. albicans 바이오필름에 대해 30분과 60분 처리 시 시간 의존적으로 유의한 항진균 효과를 나타냈으며, 그 감소 폭은 열중합 재료에서 가장 크게 관찰되었다. 4주 동안의 중성 인공 타액 및
L. plantarum CFS 산성도를 모사한 인공 타액 침전 환경에서 의치상 재료의 표면 거칠기는 유의한 변화를 보이지 않았고, 색 안정성은 모든 실험군에서 임상적 허용 범위 내에 머물렀다. 이러한 결과는 L. plantarum CFS가 의치 재료의 물리적 및 광학적 특성에 불리한 영향을 미치지 않으면서도 유의한 항진균 효과를 나타내어, 의치 관련 구강 칸디다증 관리에서 postbiotics 기반 보조 치료 전략으로서의 잠재적 활용 가능성을 뒷받침한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Introduction
Oral candidiasis, predominantly caused by Candida albicans (C. albicans), remains a frequent opportunistic infection among immunocompromised and elderly denture wearers. Conventional antifungal therapy is increasingly compromised by drug resistance, treatment failures, and the resilient biofilm formed by hyphal C. albicans. As a promising microbiome modulating strategy in the dental field, postbiotic approaches such as the cell-free supernatant (CFS) of Lactiplantibacillus plantarum (L. plantarum) have demonstrated antimicrobial activity against oral pathogens, yet evidence directly validating their efficacy against antifungal-resistant C. albicans biofilms on denture bearing surfaces remains scarce. In addition, denture base materials fabricated by different methods, including heat polymerization, CAD-CAM milling, and 3D printing, exhibit variable surface properties that may influence microbial adhesion, yet their interaction with probiotic-derived antifungal effects has not been fully elucidated, highlighting the need for further studies to bridge this gap toward clinical translation.

Materials and Methods
Disc specimens (20 mm × 3 mm) were fabricated from three denture base materials: heat polymerized PMMA (SR Triplex Hot, H), 3D printed methacrylate resin (New Base, P), and CAD/CAM-milled PMMA (Ivotion base, M), and polished. Antifungal-resistant C. albicans strains to amphotericin B, fluconazole, and nystatin (Amp-RS, Flu-RS, Nys-RS) were induced, and hyphal-form biofilms were established on the specimens. L.plantarum CFS was applied for 10, 30, and 60 min. Antifungal effects were assessed by colony-forming unit (CFU) counts and Live/Dead fluorescence staining. Surface roughness (Ra, Rq, Sa, Sq) was analyzed using Confocal laser scanning microscopy(CLSM) before immersion and after 4 weeks. Color stability was evaluated from CIE L*a*b* values, and ΔE* (SCE) was determined after 1, 2, and 4 weeks of immersion.

Results
L. plantarum CFS derived postbiotic activity significantly reduced viable counts of antifungal-resistant C. albicans biofilms over time, with significant reductions at 30 and 60 minutes (p < 0.05). The antifungal effect was denture base material dependent, being greatest on heat polymerized, intermediate on milled, and lowest on 3D printed resins. After 4 weeks of immersion in neutral or acidic artificial saliva, no significant changes were observed in surface roughness parameters (Ra, Rq, Sa, Sq), and no clinically meaningful changes were detected in color stability, as all ΔE* values remained below the clinical perceptibility threshold (ΔE* < 3.3).

Conclusion
L. plantarum CFS with postbiotic activity exhibited a time-dependent antifungal effect against drug-resistant C. albicans biofilms across heat polymerized, milled, and 3D printed denture base materials, with the most pronounced reductions observed on heat polymerized resins. A 4-week immersion in neutral or acidic artificial saliva did not result in statistically significant changes in surface roughness and did not induce any color difference exceeding the established clinical acceptability threshold. Collectively, these findings support the feasibility of L. plantarum CFS as a biologically compatible antifungal adjunct for denture-associated candidiasis without compromising the surface roughness and optical properties of denture base materials.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and Methods 6
• Ⅲ. Results 17
• Ⅳ. Discussion 35
• Ⅴ. Conclusions 43
• VI. References 44
• Korean Abstract 51