Stress responses of olive flounder (Paralichthys olivaceus) to acute temperature fluctuation, salinity change, and microplastic exposure Hyeong-Joon Park

국문 초록 (Abstract)

최근 몇 년간 기후변화로 인해 넙치 양식장에서 대량 폐사가 발생하는 등 심각한 경제적 손실이 초래되고 있다. 여름 및 겨울철 수온 변동과 태풍 및 집중호우로 인한 담수 유입 등의 문제가 빈번히 발생하고 있으며, 이는 넙치 양식장의 사육 환경뿐만 아니라 넙치 개체에 환경 변화에 따른 스트레스를 유발하고 있다. 또한 전 세계적으로 해양환경에서 미세플라스틱이 검출됨에 따라 새로운 오염물질로서 환경 문제가 대두되고 있다. 미세플라스틱이 해양생물의 체내에 축적될 경우 강한 독성 효과로 인해 스트레스를 유발할 수 있으며, 이는 넙치 양식장으로 유입되어 넙치가 미세플라스틱에 노출될 위험을 증가시킨다. 따라서 환경 변화로 인한 넙치의 폐사를 저감하고 안정적인 생산을 도모하기 위해서는 적정 수온 및 염분 조건과 미세플라스틱 노출에 따른 영향에 대한 조사·탐색이 선행되어야 한다. 1. 수온변화에 따른 넙치의 스트레스 반응 본 연구에서는 수온 변화에 따른 넙치의 스트레스 반응을 조사하기 위해 수온 하강 및 상승 조건에서 넙치와 넙치 수정란을 대상으로 생리학적 지표와 스트레스 관련 유전자 발현을 비교·분석하였다. 수온하강에 따른 넙치의 스트레스 반응 급격한 수온 변화는 어류의 생리학적 측면에서 스트레스를 유발한다. 본 연구에서는 넙치를 각 수온 조건 (9, 12, 15, 18 및 21℃)에서 24시간 및 48시간 동안 노출시킨 후 혈액생리학적 분석, 스트레스 단백질로 알려진 Hsp70 mRNA 발현, 산소 소비량을 조사하였다. 혈액학적 분석 결과, hematocrit (Ht) 및 hemoglobin (Hb), 혈장 코티졸 및 글루코스, aspartate aminotransferase (AST) 및 alanine aminotransferase (ALT), NH₃, 삼투질 농도(osmolality), 총단백질(total protein, TP)은 9℃ 및 12℃ 처리구에서 다른 수온 처리구에 비해 대부분의 항목에서 유의적인 차이를 보였다. Hsp70 mRNA 발현은 9℃ 및 12℃에서 낮은 발현 수준을 나타내었다. 이러한 결과는 수온 하강에 따른 넙치의 스트레스 반응을 이해하기 위한 기초자료로 활용될 수 있다. 수온상승에 따른 넙치의 스트레스 반응 본 연구는 고수온 환경에 노출된 넙치의 생존율, 혈액생리학전 변화 및 스트레스 단백질인 Hsp70 mRNA 발현을 조사하였다. 15일 간의 생존율 조사에서는, 30℃에 노출된 넙치가 10일째에 전량 폐사하였으나, 22 및 24℃에서는 100% 생존율을 보였고, 26 및 28℃ 처리구는 각각 90 및 70%의 생존율을 보였다. 혈액학적 지표인 Ht 및 Hb, 코티졸 및 글루코스, AST 및 ALT, 암모니아, 삼투질농도 및 총단백질 등 대부분의 항목에서 대조구에 비해 28 및 30℃ 실험구에서 유의한 차이를 나타내었다. 또한 혈장 내 superoxide dismutase (SOD) 및 catalase (CAT)의 활성은 22℃인 대조구에 비해 30℃에서 유의적으로 높은 결과값을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 여름철 고수온으로 인한 넙치의 폐사 저감 및 양식장 사육환경 등의 개선을 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 수온변화에 따른 넙치의 혈액생리학적 분석 및 Hsp70 mRNA 발현 본 연구에서는 수온 변화에 따른 넙치 수정란의 부화율과 미성어 및 자어 단계에서의 스트레스 반응을 규명하기 위해 혈장 내 SOD 및 CAT 활성과 Hsp70 mRNA 발현을 조사하였다. 수온 변화에 따른 넙치 수정란의 부화율은 18℃ 처리구와 비교했을 때 10℃ 처리구에서 유의한 차이를 보였다. 수온별 부화 자어의 Hsp70 mRNA 발현을 RT-PCR 및 qPCR로 분석한 결과, 18℃ 처리구보다 10℃ 및 12℃ 처리구에서 높은 발현 수준이 확인되었다. 또한 넙치의 혈장 내 SOD 및 CAT 활성은 18℃ 처리구에 비해 9℃ 처리구에서 유의하게 증가하였다. 각 수온 조건에서 24시간 및 48시간 노출 후 조직별 Hsp70 mRNA 발현을 분석한 결과, 9℃와 21℃ 처리구를 비교했을 때 간, 신장 및 비장에서는 24시간 및 48시간 노출 동안 유의한 차이를 보였으나, 아가미에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이러한 결과는 넙치 종자 생산 및 양성 과정에서 수온 관리의 중요성을 시사하는 기초자료로 활용될 수 있다. 2. 염분변화에 따른 넙치의 스트레스 반응 스트레스를 유발하는 환경 요인 중 염분 변화는 어류의 생존과 성장에 큰 영향을 미친다. 본 연구에서는 넙치 양식에 적합한 염분 범위를 규명하기 위해 각 염분 조건(25, 20, 15 및 10 psu)에서 24시간 및 48시간 동안 넙치를 노출시킨 후 혈액생리학적 분석과 Hsp70 mRNA 발현을 조사하였다. 혈액학적 분석 결과, Ht 및 Hb, 혈장 코티졸 및 글루코스, AST 및 ALT, Na⁺, K⁺, Cl⁻, NH₃, 삼투질 농도 및 총단백질은 저염분 조건인 10 psu 및 15 psu에서 다른 염분 처리구에 비해 대부분의 항목에서 유의적인 차이를 보였다. 혈장 내 SOD 및 CAT 활성 또한 자연해수 대조구에 비해 저염분 처리구에서 증가하는 경향을 나타내었다. 스트레스성 단 백질로 알려진 Hsp70 mRNA 발현 역시 저염분 조건에서 유의적으로 증가하였다. 이러한 결과는 염분 변화에 따른 스트레스가 넙치의 생체 방어 메커니즘과 항상성 유지를 위해 혈액학적 반응, 호르몬 분비 및 단백질 발현 증가로 이어지는 것으로 판단되며, 저염분 환경에 대비한 넙치 양식의 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 3. 미세플라스틱 노출에 따른 넙치의 스트레스 반응 미세플라스틱(microplastics, MPs)은 크기 5 mm 이하의 미세한 플라스틱 입자로 해양환경에서 광범위하게 검출되는 오염물질이다. 이는 하천 방류수, 하수 처리수, 양식 현장에서 사용되는 각종 사육 기자재(부표, 로프 등)로부터 발생하여 해저 퇴적물 및 육상 양식장 수조 내에 축적될 수 있으며, 양식 어류의 생리적 스트레스, 조직 손상 및 산화적 스트레스 반응을 유발할 수 있다. 본 연구에서는 미세플라스틱 노출에 따른 넙치를 대상으로 혈액생리학적 변화, 장내 미생물 군집 구조, 분자생물학적 발현 양상을 분석하였다. 장내 미생물 군집 분석 결과, 시료 유형에 따라 뚜렷한 군집 구조 변화가 관찰되었다. RNA-seq 분석을 통해서도 다양한 유전자의 발현 변화가 확인되었으며, 미세플라스틱 노출에 특이적으로 반응하는 유전자들이 규명되었다. 이러한 결과는 양식 현장 관리, 환경 정책 수립 및 학문적 응용 분야에서 실질적인 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• CHAPTER 1. General Introduction 1
• CHAPTER 2. Stress responses of olive flounder (Paralichthys olivaceus) to acute temperature fluctuation 10
• Ⅰ. Introduction 11
• Ⅱ. Materials and methods 14
• Ⅲ. Results 25
• Ⅳ. Discussion 52
• CHAPTER 3. Stress responses of olive flounder (Paralichthys olivaceus) to salinity change 61
• Ⅰ. Introduction 62
• Ⅱ. Materials and methods 66
• Ⅲ. Results 69
• Ⅳ. Discussion 80
• CHAPTER 4. Stress responses of olive flounder (Paralichthys olivaceus) to microplastic exposure 85
• Ⅰ. Introduction 86
• Ⅱ. Materials and methods 89
• Ⅲ. Results 97
• Ⅳ. Discussion 150
• References 161
• Acknowledgement (Korean) 183