Investigation of Protective Effects of Phloretic acid on Sarcopenic Obesity in Middle-Aged Mice Fed a High-Fat Diet = 고지방식이를 급여한 중년 마우스에서 phloretic acid 의 근감소성 비만 보호 효과 연구

국문 초록 (Abstract)

Phloretic acid (PA)는 phloretin 의 대사산물로 블랙 올리브, 사과와 일부 발효식품에 존재하는 천연 phenolic acid 이다. 기존 연구에서 PA 는 항노화, 항염증 및 지질축적 억제 효과가 보고되었으나, 노화·고지방식이로 인한 근감소성 비만(sarcopenic obesity) 및 관련 대사 질환에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다. 미토콘드리아 NAD⁺ 의존성 탈아세틸화효소 Sirtuin-3 (SIRT3)는 지방산 산화, 미토콘드리아 대사 및 인슐린 신호를 조절하며, 노화/비만 환경에서 SIRT3 저하는 미토콘드리아 기능저하·지방축적·인슐린저항성과 연관되어 근감소성 비만에 관여하는 조절인자로 제안된다. 본 연구는 middle-aged (MA) 마우스에 고지방식이를 급여하여 근감소성 비만을 유도하고, PA 보충이 근감소성 비만 및 관련 대사 질환에 미치는 보호 효과와 작용기전을 규명하고자 하였다. 또한 PA 의 조절 효과에 SIRT3 가 필수적인 역할을 하는지 확인하고자 하였다. 야생형(WT)과 SIRT3 결손(SIRT3KO) 129S1/SvImJ 수컷 마우스를 14 주령(Young WT)과 49 주령(MA-WT, MA-WT+PA, MA-SIRT3KO, MA-SIRT3KO+PA)으로 구분하였다. 모든 실험군에는 40 kcal% 고지방식이를 15 주간 급여하였고, PA 보충군은 PA 를 0.02%(w/w)로 첨가한 고지방식이를 동일 기간 공급하였다. 실험 기간 동안 체중·식이섭취량 및 근기능(대퇴부 두께, 악력, 트레드밀) 평가하였다. 실험 종료 후 혈액과 지방·골격근 등의 조직을 분리하여 조직 무게, 혈장/근육 지질 함량, 조직학적 변화와 지질대사·염증·근육대사 관련 분자 지표를 분석하였다. MA WT 마우스에서 PA 섭취는 체중 증가량, 식이효율, 체지방률을 유의적으로 낮추고, 백색지방조직 무게는 감소 경향을 보였으며, 에너지소비량을 증가시켰다. 또한 부고환 지방조직의 지방세포 크기와 렙틴을 감소시키고, 인슐린과 HOMA-IR 을 개선하여 지방 축적과 인슐린 저항성을 완화시켰다. 이는 PA 보충이 지방조직에서 지방합성을 억제하고 지방산 β-산화를 촉진한 결과임을 효소활성·유전자 발현 분석으로 확인하였다. RNA-seq 에서 PA 섭취군에서 인슐린 신호전달, 지방 분해 조절, 지방산 산화 관련 경로가 유의적으로 풍부하게 나타나, PA 의 지방조직에서의 지질대사 개선 효과를 확인하였다. 반면, 근감소증에 미치는 PA 의 영향을 평가한 결과, PA 는 제지방률과 비복근 무게를 증가시키고, 근육 내 지질 축적을 감소시키며, 대퇴부 두께와 악력을 향상시켜 근기능 저하를 개선하였다. 비복근에서 PA 는 지방산 산화, 근분화 및 미토콘드리아 생합성 관련 유전자의 발현을 증가시키고, 염증 관련 유전자 발현을 감소시켰다. 또한 SIRT3 와 AMPK 활성을 증가시키고 Atrogin-1 은 감소시켜, PA 가 AMPK–PGC-1α–SIRT3 축을 활성화하고 근위축 신호를 억제함을 보여주었다. PA 는 이러한 분자적 조절을 통해 노화 관련 근기능 저하를 완화한 것으로 보인다. 반면, SIRT3KO 마우스에서는 PA 섭취에도 근감소성 비만 관련 대사 개선 효과가 소실되거나 유의하지 않았고, 지방조직·골격근에서 관련 유전자의 발현 변화도 현저히 약화되었다. 다만 에너지소비량 증가와 염증 지표 감소 등 일부 PA 조절 효과는 WT 와 SIRT3KO 모두에서 관찰되어 SIRT3 비의존적임이 확인되었다. 그러나 전반적으로 SIRT3 결손 상태에서는 PA 의 근감소성 비만 억제 효과가 제한적이었다. 종합하면, PA 는 노화·고지방식이 유도 근감소성 비만 마우스 모델에서 지방조직의 지질대사를 개선하고, 골격근의 SRIT3 발현 증가와 함께 지방산 산화, 미토콘드리아 기능 및 근분화를 촉진하며, 염증과 근위축 신호를 억제하였다. 이러한 작용기전을 통해 근감소성 비만이 완화되었으며, 보호 효과는 주로 SIRT3 의존적으로 나타났다. 따라서 본 연구는 PA 가 근감소성 비만 및 관련 대사 질환 예방과 개선에 기여할 수 있는 잠재적 식이 후보물질임을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 17
• 1. Purpose of study 17
• 2. Background 24
• 2.1 Lipid metabolism in the body 24
• 2.2 Skeletal Muscle Metabolism 27
• 2.3 Sarcopenic Obesity in Aging 31
• II. MATERIAL AND METHODS 32
• 1. Animals and experimental design 32
• 2. Grip strength, Thigh thickness and Treadmill test 35
• 3. Blood glucose and intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) 35
• 4. Energy expenditure analysis 36
• 5. Body composition analysis 36
• 7. Plasma analysis 36
• 7.1 Plasma lipids analysis 36
• 7.2 Plasma adipocytokine and myokine analysis 37
• 7.3 Plasma glucose, insulin and HOMA-IR 37
• 8. Epididymal WAT tissue enzyme activities analysis 37
• 8.1 Subcellular fractionation of epididymal WAT tissue for enzyme activity analysis 37
• 8.2 Enzyme activity in Epididymal WAT 38
• 9. Muscle lipids analysis 38
• 10. Histological Analysis 39
• 10.1 Histological Analysis of muscle tissue 39
• 10.2 Histological Analysis of adipose tissue 39
• 11. RNA isolation and quantitative real-time PCR analysis 39
• 11.1 RNA extraction and cDNA synthesis 39
• 11.2 Quantitative real-time PCR 40
• 12. Western blot analysis 43
• 13. RNA-seq analysis 44
• 13.1 RNA purification and sequencing 44
• 13.2 Analysis of differentially expressed genes 45
• 14. Statistical Analysis 45
• III. RESULT 46
• 1. Effects of phloretic acid on food intake, body weight, organ weight, body composition and adipose tissue weight and histological analysis 46
• 1.1. Food intake, body weight, body weight gain and food efficiency ratio 46
• 1.2. Adipose tissue, skeleton muscle and organ weights 48
• 1.3. Body composition and bone parameters 51
• 1.4. Histological analysis of epididymal WAT 53
• 2. Effects of phloretic acid on fasting blood glucose level, plasma glucose level, IPGTT, IPGTT AUC, plasma insulin level and HOMA-IR 55
• 3. Effects of phloretic acid on plasma lipid levels 57
• 4. Effects of phloretic acid on muscle function, lipid levels, histological analysis of muscle and plasma myokines levels 59
• 4.1. Muscle thigh thickness, grip strength and treadmill maximal exercise capacity 59
• 4.2. Muscle lipids and muscle histological analysis 61
• 4.3. Plasma myokine levels 64
• 5. Effects of phloretic acid on lipid metabolism in adipose tissue 66
• 5.1. Adipose lipid metabolism-related enzyme activity 66
• 5.2. Adipose gene expression related to lipid metabolism 68
• 6. Effects of phloretic acid on inflammation-related gene expression in muscle 71
• 7. Effects of phloretic acid on fatty acid oxidation-related gene expression in muscle 73
• 8. Effects of phloretic acid on myogenesis and mitochondrial biogenesis gene expression in muscle 75
• 9. Effects of phloretic acid on muscle protein expression 78
• 10. RNA sequencing analysis of adipose 80
• IV. DISCUSSION 85
• 1. Effects of phloretic acid on adipose tissue lipid metabolism, insulin resistance, inflammation and dyslipidemia in WT middle-aged mice 86
• 2. Effects of phloretic acid on Skeletal Muscle mitochondrial function, lipid metabolism and myogenic differentiation in middle-aged WT mice 89
• 3. Effects of phloretic acid on adipose tissue lipid metabolism: RNA sequencing analysis of underlying molecular mechanism in middle aged WT mice 95
• 4. Effects of phloretic acid on metabolic and skeletal muscle changes in middle-aged SIRT3KO mice 96
• V. CONCLUSION 102
• VI. REFERENCE 104