Development of a risk-assessment framework for white spot disease in whiteleg shrimp (Penaeus vannamei) aquaculture

국문 초록 (Abstract)

흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)는 1993년 대만에서 처음 보고된 이후 전 세계로 빠르게 확산되었으며, 현재는 새우 양식 산업에 가장 치명적인 병원체 중 하나로 인식되고 있다. WSSV 에 감염된 새우는 일반적으로 무기력증, 체색의 붉은 변색, 그리고 외골격에 뚜렷한 흰반점 형성 등의 임상 증상을 보이며, 감염 후 3–10 일 이내에 대량 폐사가 발생하는 특성을 나타낸다. 이처럼 높은 병원성과 전염력을 지닌 WSSV 는 지금까지 전 세계적으로 약 210 억 달러 이상의 누적 경제적 손실을 초래한 것으로 추정된다. 그럼에도 불구하고, 흰반점병(white spot disease, WSD)에 대한 효과적인 방어 전략은 아직 마련되지 않아, 양식현장에서 질병을 조기에 감지하고, 효과적인 관리방안을 마련하기 위해서는 질병의 역학적 정보에 기반한 위험 평가 체계의 구축이 시급한 실정이다. 이에 따라, 본 연구에서는 흰다리새우(Penaeus vannamei)를 대상으로 한 WSD 의 질병 진행 경과에 따른 감염등급의 역학적 변화, 해수 및 퇴적물의 환경 내 전파 매개체로서의 역할, 다양한 양식 조건에서의 WSD 전파 동역학, 그리고 WSD 발생에 영향을 미치는 주요 위험요인을 종합적으로 조사하였다. 본 연구의 궁극적인 목적은 WSD 에 대한 역학적 근거 기반의 통합적 위험 평가 체계를 구축함으로써, 양식현장 내 질병 조기 감지 전략 수립을 지원하고, 건강 상태에 따른 적합한 관리전략 방안을 제시하여, WSD 으로 인한 손실 최소화 및 새우 양식 산업의 지속가능성을 제고하는 데 있다. WSD 의 질병 진행 경과에 따른 감염등급의 역학적 변화를 조사하기 위해 근육주사 감염 실험(실험 1) 침지 감염 실험(실험 2)을 수행하였다. 실험1에서는 흰다리새우에 103 WSSV genome copies/shrimp 의 농도로 근육주사를 수행한 후, WSSV 의 복제 특성과 감염등급 간의 상관관계를 조사하였다. 그 결과, 감염 경과에 따라 경증(G0–G1), 중등도(G2–G4), 중증(G4) 등 세 가지 감염 단계로 구분되는 명확한 감염 양상이 확인되었으며, 임상적 변화(바이러스 방출, 식욕부진, 빈사상태)과 감염 중증도 간의 상관관계 또한 확인할 수 있었다. 실험 2 에서는 반복 침지 실험을 통해 WSSV-Te-14 분리주의 잠복기 및 이환율을 추정하였으며, WSSV-Te-14 분리주의 잠복기는 32 시간에서 96 시간 수준으로 확인되었다. WSD 이환율의 경우, 무증상 단계에서 감염 상태로의 이환율(λai)과 감염에서 폐사 상태로의 이환율(λid)은 각각 감염 후 40–48 시간, 및 64–72 시간에 최고치를 기록하였다. 종합적으로, WSD 의 진행 과정에서 흰다리새우는, WSSV 의 잠복기인 경증 단계에서 무증상 감염상태이나, 바이러스를 방출할 수 있으며(G0–G1; 0–48 시간 후), 대수증식기인 중등도 단계에서 식욕부진 및 빈사 상태 등 뚜려함 임상증상을 나타내게 되고(G2–G3; 48–72 시간 후), 정체기인 중증 단계(G4; 72–120 시간)로 진행되었다. 본 연구에서 조사한 WSD 의 질병 진행 경과에 따른 감염등급의 역학적 변화는 WSD 에 대한 양식현장 내 흰다리새우의 건강상태를 정밀하게 평가할 수 있는 기준을 제공함과 동시에, 양식장 내 WSD 의 잠재적 영향을 이해하는 데 중요한 과학적 근거를 제시할 것으로 사료된다. WSD 전파에 있어, 해수와 퇴적물의 전파 매개체로서의 역할을 규명하고자, viability-qPCR (v-qPCR)을 활용한 WSSV 의 감퇴 역학을 조사하였다. 시간 경과에 따른 감염성 WSSV의 생존력 분석 결과, 여과 해수에서는 30, 25, 20, 12, 4 °C 의 온도조건 에서 각각 최대 9 일, 13 일, 35 일, 42 일, 70 일까지 감염성이 유지되었고, 환경 해수에서는 각각 5 일, 7 일, 13 일, 28 일, 42 일까지 생존하였다. 온도가 낮아질수록 해수 내 바이러스의 생존 기간은 증가하였으며, T90 및 T99 값은 여과 해수에서 30 °C 기준 4.04 일 및 6.11 일에서 4 °C 에서는 29.79 일 및 44.28일로 증가하였다. 환경 해수에서도 동일 온도에서 T90 및 T99 값이 각각 1.13 일 및 2.26 일에서 9.55 일 및 19.10 일로 증가하였다. 모든 시험 조건 중 퇴적물에서의 바이러스 생존력이 가장 오래 유지되는 것으로 나타났으며, 4 °C 조건에서 T90 및 T99 값은 각각 53.98 일과 84.55 일에 달하였다. 선행 연구에 따르면, 실제 양식환경 내의 복잡한 생물학적 상호작용이 실험실에서 예측된 바이러스 생존 기간 보다 더 오래 지속되도록 만들 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구를 통해 도출된 T90 및 T99 값은 WSD 의 전파과정에 있어, 저질은 장기적 바이러스 저장소, 그리고 해수는 병원체의 효과적인 확산 매개체로 작용한다는 점을 시사하고 있으며, 양식현장 내 유입/배출수 그리고 저질에 대한 정기적인 WSSV 모니터링과, 적절한 소독조치를 수행함으로써, 생물보안의 외부 및 내부장벽으로부터의 WSD 확산을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다. 실제 양식 현장 내에서의 WSD 전파역학적 특성을 규명하고자, 계절적 환경 변화를 모사한 조건하에서, 사육 밀도 및 수온의 조합에 따른 흰다리새우의 WSD 전파 역학적 모델링을 수행하였다. 본 연구에서는 4 가지 사육 밀도(46.67, 70, 140, 및 210 마리/m2)와 2 가지 온도 조건(25 °C 및 30 °C)에서 동거사육(cohabitation) 실험을 수행하였으며, 각 실험군에는 WSSV 에 감염된 새우 1 마리와 비감염 새우들이 포함되었다. 25 °C 조건에서는 사육 밀도가 증가함에 따라 누적 폐사율도 비례적으로 증가하였으며, 46.67 마리/m2 조건에서 13.33 ± 12.47%였던 폐사율은 210 마리/m2 조건에서 84.89 ± 6.36%에 이르렀다. 유사한 밀도 의존적 경향은 30 °C 조건에서도 관찰되었으나, 질병의 전파는 140 및 210 마리/m2 의 밀도 조건에서만 확인되었다. 이후 WSD 전파 역학적 특성은 SIR 모델을 통해 정량화되었으며, 질병 특이적 및 자연 폐사 데이터를 기반으로 가중 최소제곱법(weighted least squares, WLS)을 사용해 모델을 보정하였다. 최적화된 모델은 사육 밀도의 증가와 WSSV 복제에 유리한 수온 조건이 WSD 전파를 가속화함을 보여주었으며, 이는 높은 기본 재생산지수(R0), 더 큰 최종 감염 규모(Rsize), 그리고 조기 감염 정점 도달 시점(Ipeak)으로 확인되었다. 특히, R0 추정치는 저밀도 조건에서 1 미만으로 떨어졌으며, 이는 25 °C 에서 46.67 마리/m2, 30 °C 에서는 70 마리/m2 미만 조건에서 관찰되었다. 이러한 결과는 양식장 내 수온이 WSSV 복제를 위한 최적 조건 내에 해당되더라도, 낮은 밀도 조건에서는 WSD 의 발생 위험이 유의적으로 감소할 수 있음을 나타내고 있다. 본 연구에서 개발한 WSD 전파 역학 모델은 다양한 환경 및 사육 조건 하에서의 WSD 전파 위험성을 정량적으로 파악할 수 있는 지표를 제공하고 있다. 이와 같은 질병 확산 모델링은, 실제 양식현장에서의 질병 발생 위험 평가체계에 도입에 근간이 되는 정보를 제공할 수 있으며, 질병 예측 시스템 및 병원체 조기 감지 전략과 연계 된다면, 임상 증상 발현 전에 WSSV 감염을 신속히 식별하고, 효과적인 질병 관리 및 집약 양식 시스템의 생물 보안 체계 강화에 기여할 수 있을 것으로 사료된다. 마지막으로, 본 연구에서는 흰다리새우 양식장에서의 WSD 발생에 영향을 미치는 주요 위험요인을 규명하고, 주요 위험요인들이 연못 수준에서의 건강 상태에 미치는 영향을 평가하여, 양식현장에서의 최적화된 WSD 위험 평가 체계를 구축하고자 하였다. 35 개의 잠재적 위험요인 변수를 대상으로 한 단변량 분석 및 주요 위험요인을 바탕으로 한 다변량 모델 분석 결과, 시기(가을철), 높은 사육 밀도(≥ 56.3 PL/m2), 그리고 사육수 내에서의 WSSV 검출은 WSD 발생과 유의한 양의 상관관계를 나타내었으며, 석회 처리와 프로바이오틱스 사용은 유의적인 음의 상관관계를 나타냈다. 연못 내 새우의 건강 상태 평가는 WSSV 검출률, 감염 중증도 등급, 그리고 임상 증상의 유무를 기준으로 수행되었으며, 높은 사육 밀도(≥ 56.3 PL/m2)는 WSSV 검출률 증가와, 그리고 프로바이오틱스 사용 및 체색 적변 증상은 감염 중증도 등급과 유의적인 상관관계를 나타내었다. 또한, 사육수에서의 WSSV 검출과 폐사 개체의 경우, WSSV 검출 및 감염 중증도 모두와 유의적인 상관관계를 나타내었다. 현재 WSSV 에 대한 효과적인 방제 수단이 부재한 상황에서, WSD 발생과 관련된 위험요인을 식별하고 이를 관리하는 것은 질병 확산을 저감하고 새우 양식 산업의 지속가능성을 확보하기 위한 근거 기반 전략 수립에 필수적이다. 이에 따라, 본 연구는 양식장 수준의 위험 지표, 위험기반 시료 채취 및 환경 유래시료 분석을 포함하는 위험 평가체계와 WSD 의 감염등급에 따른 질병 제어전략을 통합한 WSD 위험평가 프레임워크를 제안하였다. 본 통합 프레임워크는 양식현장에서 WSD 를 조기에 감지하고, 현재 건강상태 평가에 대한 과학적 근거를 제공함으로써, WSD 발생으로 인한 손실을 줄이고 새우 양식장의 안전성과 지속가능성을 제고하는 데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter Ⅰ. Estimation of white spot syndrome virus severity grades dynamics in whiteleg shrimp (Penaeus vannamei) during the disease transition process 1
• I. Introduction 1
• II. Materials and methods 4
• 1. Virus 4
• 2. Whiteleg shrimp 6
• 3. Total DNA purification 5
• 4. Quantitative analysis 5
• 5. Concentration of WSSV particles in rearing seawater. 8
• 6. Time-course evaluation of severity grades and infection-associated changes in WSSV-infected whiteleg shrimp 9
• 6-1. Determination of WSSV severity grades in whiteleg shrimp 9
• 6-2. In vivo titration for intramuscular challenge test 10
• 6-3. (Exp. 1) Investigation of WSSV replication properties in whiteleg shrimp 12
• 7. Investigation of WSD transition dynamics in whiteleg shrimp 13
• 7-1. Classification of WSD transition 13
• 7-2. (Exp. 2) Estimation of the WSD transition rate in whiteleg shrimp 14
• 8. Statistical analysis 15
• III. Results 16
• 1. (Exp. 1) WSSV replication properties in infected whiteleg shrimp 16
• 1-1. Survival tendency of whiteleg shrimp in an intramuscular injection challenge 16
• 1-2. Time-course WSSV loads of whiteleg shrimp in an intramuscular injection challenge 16
• 1-3. Viral shedding rate of whiteleg shrimp in an intramuscular injection challenge 16
• 2. Correlations between WSSV loads and infection-associated changes in whiteleg shrimp 19
• 3. (Exp. 2) WSD transition dynamics following an immersion challenge 21
• 3-1. Infection probability of whiteleg shrimp in an immersion challenge 21
• 3-2. Estimated WSD transition in whiteleg shrimp 23
• IV. Discussion 27
• Chapter Ⅱ. Decay kinetics of white spot syndrome virus in seawater and sediment: implications for reservoir-mediated transmission 38
• I. Introduction 38
• II. Materials and methods 41
• 1. Virus preparation 41
• 2. Source of seawater and sediment 41
• 3. Experimental shrimp 42
• 4. Quantitative analysis 43
• 4-1. Quantitative PCR analysis 43
• 4-2. Assessment of WSSV viability using v-qPCR assay 44
• 5. WSSV extraction methods from seawater and sediment 45
• 5-1. Iron flocculation assay for concentrating WSSV from seawater 45
• 5-2. Extraction of WSSV from sediment using the S∙E−I∙O method 46
• 6. Evaluation of the viability of WSSV extracted from seawater and sediment 47
• 6-1. v-qPCR assay of WSSV extracted from seawater and sediment 47
• 6-2. Bioassay of WSSV extracted from seawater and sediment 48
• 7. Evaluation of WSSV decay kinetics in transmission reservoirs 49
• 7-1. Sample preparation 49
• 7-2. Evaluation of the time-course WSSV viabiltiy at different conditions. 51
• 7-3. Estimation of the WSSV decay kinetics 53
• 8. Statistical analysis 54
• III. Results 55
• 1. Applicability of the v-qPCR assay for WSSV extracted from seawater and sediment 55
• 2. WSSV viability in reservoirs under different temperature conditions 58
• 2-1. Time-course quantification of WSSV using qPCR and v-qPCR under different conditions 58
• 2-2. Time-course viability of stored WSSV at differenbt temperature conditions 63
• 3. WSSV decay kinetics in reservoirs under different temperature conditions 69
• 3.1. Estimated T90/T99 values based on the selected WSSV decay model 69
• 3.2. Correlation between bioassay results and T90/T99 values in the WSSV decay model 75
• IV. Discussion 76
• Chapter III. Estimating transmission parameters of white spot disease in whiteleg shrimp (Penaeus vannamei) using a number-based SIR (βSI) model 84
• I. Introduction 84
• II. Materials and methods 87
• 1. Virus and experimental shrimp 87
• 2. Nucleic acid extraction and PCR amplification 88
• 3. Estimation of WSD transmission dynamics under different environmental conditions 89
• 3-1. Experimental conditions 89
• 3-2. Cohabitation challenge 91
• 3-3. SIR model for estimate of WSD transmission dynamics in whiteleg
• shrimp 91
• 3-4. Testing and optimization of SIR model 93
• III. Results 94
• 1. Cumulative mortality of whiteleg shrimp in cohabitation challenge 94
• 2. Estimated WSD transmission dynamics using SIR model 97
• IV. Discussion 103
• Chapter ⅠV. Establishment of an optimal risk-assessment framework for white spot disease in whiteleg shrimp (Penaeus vannamei) farms 111
• I. Introduction 111
• II. Materials and methods 114
• 1. Assessment of risk factors associated with WSD incidence in whiteleg shrimp farms 114
• 1-1. Study area 114
• 1-2. Establishment of questionnarie and data collection 117
• 1-3. Definition of terms 119
• 2. WSSV extraction methods from environmental samples 122
• 2-1. Concentrate method for WSSV in seawater 122
• 2-2. Extraction method for WSSV in sediment 122
• 3. Quantitative analysis and determination of WSSV severity grades in whiteleg shrimp 123
• 4. Statistical analysis 123
• 4-1. Estimation of the WSD prevalence in farm and pond scale 123
• 4-2. Univariate analysis to identify the significant variables associated with WSD incidence. 124
• 4-3. Multivariate logistic regression and establishment of the final risk-associated factor model 124
• 4-4. Assessing the influence of identified risk factors on infection status at pond-scale . 125
• 4-5. Evaluation of the correlation between WSSV loads in environmental samples and pond-scale infection status 126
• III. Results 127
• 1. Farm-scale WSD prevalence and disease severity grades 127
• 2. Results of the surveys assessing farm-scale risk factors for WSD incidence 130
• 3. Identification of risk factors associated with WSD incidence in whiteleg shrimp farms 134
• 3-1. Potential risk factors for WSD incidence identified by univariable logistic regression 134
• 3-2. Identified risk factors associated with WSD incidence at the farm scale 136
• 4. Influence of identified risk factors on infection status at pond-scale 138
• 5. Correlation between WSSV loads in environmental samples and infection status of pond 142
• IV. Discussion 143
• 1. Correlation between risk-associated factors and WSD incidence in shrimp farms 144
• 1-1. Farm characteristics 144
• 1-2. Environmental factors 145
• 1-3. Management (culture practices) 146
• 1-4. Management (biosecurity practices) 147
• 1-5. WSSV detection in environmental samples 149
• 2. Correlation between identified risk factors and pond-scale health status in WSD 151
• 3. Correlation between WSSV infection-associated changes and pond-scale health status 151
• 4. WSD risk-assessment framework 153
• 4-1. Application of disease risk-associated factors for WSD risk-assessment strategy . 153
• 4-2. Risk-based and environmental sampling for WSD risk-assessment strategy 158
• 4-3. Interpretation of WSD monitoring outcomes to enhance shrimp farm management 159