Development and validation of multienzyme isothermal rapid amplification assay for detection of Megalocytivirus pagrus I

국문 초록 (Abstract)

Megalocytiviruses는 전 세계 해산 및 담수어를 포함한 다양한 어류에서 높은 폐사율과 심각한 경제적 피해를 초래하는 주요 병원체이다. 국제바이러스분류위원회(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)는 최근 참돔이리도바이러스병(Red sea bream iridoviral disease, RSIVD)을 포함한 감염병을 Megalocytivirus pagrus 1으로 재분류하였고, 이 종에는 red sea bream iridovirus (RSIV), infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV), turbot reddish body iridovirus (TRBIV)의 세 유전형이 포함된다. 감염 어류는 무기력, 비정상적 유영, 빈혈, 비장과 신장의 비대 등의 증상을 보이며, 무증상 개체에서도 낮은 농도의 병원체(102–104copies/μL)가 검출될 수 있어 조기 진단이 중요하다. 현재까지 Megalocytivirus 검출을 위해 세포배양법, 간접형광항체법(Indirect Fluorescent Antibody Test; IFAT), conventional PCR, real-time PCR, nested PCR 등의 분자진단법이 개발되어 왔다. 이 중 PCR 기반 진단법은 높은 특이도와 민감도를 제공하지만, 고가의 온도 조절 장비, 숙련된 인력 등이 필요하여 현장 진단에는 적용이 어렵다. 이에 따라 등온 증폭 기반의 진단기술이 새로운 대안으로 주목받고 있다. 등온증폭법은 일정한 온도(25–42 °C)에서 효소 반응이 진행되어 복잡한 온도 사이클링이 필요 없으며, 짧은 시간(5–30분) 내에 표적 핵산을 신속히 증폭할 수 있다. 그중 다중효소 등온신속증폭(multienzyme isothermal rapid amplification, MIRA)은 재조합효소, 단일가닥결합단백질, DNA 중합효소의 상호작용을 통해 효율적으로 DNA를 증폭할 수 있고, Exonuclease (EXO) 프로브를 적용하면 실시간 형광 검출이 가능하여 반정량적 분석에도 활용할 수 있다. 본 연구에서는 Megalocytivirus pagrus 1의 세 유전형(RSIV, ISKNV, TRBIV)을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 digital MIRA-EXO 기반 진단법을 개발하고, 그 분석적·진단적 성능을 종합적으로 평가하였다. MCP(major capsid protein) 유전자의 보존 영역을 표적으로 프라이머 및 EXO 프로브를 설계하였으며, 반응은 39°C에서 20분 간 수행되었다. LoB(limit of blank)는 24회 음성반응(Non-template control, NTC)의 평균 및 표준 편차를 이용해 산출한 결과 3.34로 결정되었으며, 장비 형광값이 이 기준을 초과할 경우 양성으로 판정하였다. Probit 분석을 통한 검출한계(LoD95%)는 RSIV 201.6 copies/μL, ISKNV 146.9 copies/μL, TRBIV 182.0 copies/μL로 확인되었으며, 이는 conventional PCR(225.81 copies/reaction), CPA-LFA(385.76 copies/μL)와 유사하지만, real-time PCR(0.2–2 copies/reaction)에 비해 약 20–1,000배 낮은 민감도를 나타내었다. 그러나 digital MIRA-EXO는 30분 내에 분석이 완료되어 기존 PCR(약 2시간)이나 real-time PCR(약 1시간)에 비해 진단 시간이 2–3배 단축되는 장점을 보였다. 총 180개의 인위감염 시료를 이용한 진단 성능 검증 결과, 진단 민감도(DSe) 92.22%, 진단 특이도(DSp) 100%, 양성 예측도(PPV) 100%, 음성 예측도(NPV) 92.78%, 전체 정확도 96.11%를 보였으며, Receiver Operating Characteristic (ROC) 분석 결과 Area Under the Curve (AUC)는 0.971로 탁월한 진단 성능(excellent performance)을 나타냈다. 또한 WOAH technical disease card에서 권고하는 Cummins 및 Koda real-time PCR 진단법을 포함한 총 6종의 PCR 기반 진단법과 비교하였을 때, digital MIRA-EXO는 이들과 동등하거나 더 높은 진단 신뢰도를 보였다. 진단법 간 일치도(Fleiss’ kappa)는 인위감염 시료에서 0.786, 현장 시료에서 0.792로 나타나 '상당한 일치(substantial agreement)' 수준으로 평가되어 진단법 간 결과의 신뢰성이 높은 것으로 확인되었다. DNA 추출 방법 간 일치도(Cohen’s kappa)는 0.783으로 확인되어 컬럼 기반 추출법과 직접 용해(rapid extract lysis)법 간 진단 결과 차이가 없음을 입증하였다. 특히 직접 용해 추축법을 적용해도 real-time PCR 및 digital MIRA-EXO 간 상관계수(r = 0.98–0.999, p < 0.001)가 매우 높아, 단순화된 전처리 조건에서도 높은 재현성을 확보할 수 있음을 확인하였다. 결과적으로, 본 연구에서 개발된 digital MIRA-EXO 진단법은 Megalocytivirus pagrus 1을 대상으로 높은 정확도와 특이도를 유지하면서도 반응 시간이 짧고 장비 의존도가 낮아 현장 환경에서도 즉각적인 병원체 검출이 가능하다. 이러한 결과는 본 연구에서 개발된 진단법이 megalocytiviruses를 신속하고 정확하게 검출할 뿐만 아니라, 현장 진단에도 적용 가능한 진단방법임을 입증한다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• II. Materials and methods 4
• 1. Virus culture 4
• 2. Optimization of the digital MIRA-EXO assay 5
• 2-1. Primers and probe design 5
• 2-2. Digital MIRA-EXO condition 8
• 2-3. Quantitative standard construction 10
• 2-4. Limit of blank determination 11
• 3. Analytical specificity and sensitivity test 12
• 3-1. Analytical specificity 12
• 3-2. Analytical sensitivity 13
• 4. Diagnostic performance of digital MIRA-EXO assay 14
• 4-1. Experimentally infected samples 14
• 4-2. Determination of diagnostic performance parameters 16
• 5. Application of digital MIRA-EXO assay 18
• 5-1. Comparative analysis of DNA extraction efficiency 18
• 5-2. On-site applicability of the digital MIRA-EXO assay 19
• III. Results 25
• 1. Establishment of quantitative standard curves and determination of LoB 25
• 2. Analytical specificity and analytical sensitivity 27
• 3. Diagnostic performance of digital MIRA-EXO 29
• 4. Comparison of diagnostic performance between diagnostic assays 32
• 5. Comparative analysis of DNA extraction efficiency 35
• 6. On-site applicability of the digital MIRA-EXO assay 38
• IV. Discussion 40
• SUMMARY 45
• REFERENCES 46