Functional Analysis of Key Pathways Regulating Muscle Maturation Using siRNA Screening = siRNA screening을 활용한 근육 재생 및 성숙을 조절하는 핵심 인자 발굴 및 검증

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

For an injured muscle to fully recover, terminal maturation is crucial for regenerating myofiber. However, specific signaling pathways that regulate regeneration remain unclear. Samples were collected from 5 different time points of regenerating mouse tibialis anterior (TA) muscle and built a map of in vivo regeneration using single nucleus RNA sequencing. From this high-resolution analysis, cell-cell interactions between different cell types were analyzed and the results revealed major pathways upregulated during muscle regeneration. Data from bulk RNA sequencing of an in vitro C2C12 muscle culture model was used to cross-check ligand-receptor signals upregulated and to select candidate receptors that overlapped in both data. By using siRNA screening method, different candidate receptors were knocked down to unveil which signal is important. NRG-1/Erbb3 receptor/ligand was suggested as a crucial regulatory pathway of C2C12 differentiation and maturation. To eliminate siRNA non-specific immune response of siRNA transfection, Tbk1 was knocked out using CRISPR-Cas9. However, knockout C2C12 showed lower differentiation rate compared to WT C2C12, suggesting a new role of TBK1 in muscle differentiation, other than its canonical role in innate immune systems.

국문 초록 (Abstract)

손상된 근육이 완전히 회복되기 위해서는 재생하는 근섬유의 말기 성숙이 매우 중요하게 작용한다. 하지만 이러한 재생 과정을 조절하는 구체적인 신호 전달 체계 가 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 쥐의 전경골근에 손상을 유도한 후, 재생 중인 근육의 샘플을 총 5가지 시점별로 수집하여, 단일 핵 RNA 시퀀싱을 수 행하였다. 이 고해상도 분석을 통해 세포 간 상호작용을 분석하였고, 근육 재생 과정 중 발현이 증가되는 주요 신호 전달 경로들을 규명하였다. 또한 in vitro C2C12 근육 배양 모델에서의 Bulk RNA 시퀀싱 데이터를 활용해 단일 핵 RNA 시퀀싱 데이터와 의 교차 검증을 진행하여 두 데이터에서 모두 발현이 증가하는 리간드-수용체 신호를 특정하였다. 이를 추가 검증하기 위하여 본 연구에서는 siRNA 스크리닝을 통해 각 후보 수용체를 넉다운 (knockdown)시켜 핵심 신호 전달 체계를 알아보고자 하였다. 그 결과, NRG-1/Erbb3 리간드/수용체 경로가 C2C12 세포주에서 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다. 추가로, siRNA의 비특이적인 면역 반응을 배제하기 위해 Tbk1을 CRISPR-Cas9을 이용하여 녹아웃 (knockout)을 시켰다. 하지만, Tbk1 녹아웃 세포는 야생형 C2C12에 비해 분화율이 낮아지는 것을 보여주었다. 이는 TBK1의 선천성 면역 체계에서의 전통적인 역할 이외에, 분화에도 역할을 수행하고 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 6
• 2.1. Cell Line 6
• 2.2. siRNA and Poly I:C transfection 6
• 2.3. Matrigel Coating 7
• 2.4. Treatment of recombinant Neuregulin 7
• 2.5. RNA extraction and Quantitative Real-Time PCR (RT-qPCR) 7
• 2.6. Western Blot 8
• 2.7. Image acquisition and analysis 9
• 2.8. Statistical analysis 9
• 3. Results 12
• 3.1. Matrigel coating shows no effect on C2C12 myogenic differentiation 12
• 3.2. Initial siRNA screening of secreted receptors identifies Erbb3 as a critical receptor for myogenic maturation 15
• 3.3. CRISPR-mediated TBK1 KO establishes a platform free of interferonresponse 19
• 3.4. TBK1 KO impairs intrinsic C2C12 differentiation capacity 22
• 3.5. NRG-1 ligand treatment confirms Erbb3-mediated promotion of muscle maturation 25
• 4. Discussion 28
• 5. References 31