해수에서 분리한 Escherichia coli Bacteriophages의 특성 분석 및 생굴(Crassostrea gigas)에 대한 적용 = Characterization of Escherichia coli Bacteriophages Isolated from Seawater and Their Application to Raw Oysters (Crassostrea gigas)

국문 초록 (Abstract)

Escherichia coli는 장내세균과에 속하는 대표적인 세균으로, 일부 병원성 계통은 사람에게 설사, 복통, 구토 등 위장관 질환을 유발할 수 있는 중요한 식중독 원인균이다. 특히 물이나 식품을 매개로 감염되는 장관성 E. coli는 오염된 식수, 채소, 과일 등에서 흔히 발견되며, 패류와 같은 수산식품 역시 주변 수질의 영향을 받아 쉽게 오염될 수 있다. E. coli는 사람이나 동물의 분변, 오염된 작업 도구·조리 환경 등을 통해 식품으로 전이될 수 있으며, 이러한 교차오염은 식중독 발생의 주요 원인이 된다. 또한 E. coli가 원인이 되는 설사 질환은 전 세계적으로 여전히 높은 발생률을 보이며, 특히 영유아·고령자·면역저하자의 경우 심각한 탈수, 지속성 설사 등 중증으로 이어질 가능성이 높아 중요한 공중보건 문제로 다뤄지고 있다. 따라서 본 연구에서는 전라남도 목포시와 무안군 해수로부터 E. coli ATCC 25922 및 Shigella sonnei KCTC 12004에 특이성을 갖는 bacteriophage 3종(EcBP-1, EcBP-2, SsBP-1)을 분리하고, 이들의 생물학적, 화학적 특성 및 굴 표면에서의 E. coli 저감 효과를 평가하였다. Host range test 결과 EcBP-1은 E. coli ATCC 25922와 굴 유래 E. coli 2종을, EcBP-2는 굴 유래 E. coli 5종을 추가로 감염시켰으며, SsBP-1은 E. coli, S. sonnei와 굴 유래 E. coli 4종을 추가로 감염시키는 것을 확인하였다. 형태학적 분석 결과 EcBP-1과 EcBP-2는 Myoviridae, SsBP-1은 Siphoviridae 계통으로 분류되었다. One-step growth 분석에서 EcBP-1은 약 25분의 latent time과 약 1.4 log PFU/mL 수준의 burst size를 보였으며, EcBP-2와 SsBP-1은 약 15분의 latent time과 약 1.7 log PFU/mL의 burst size를 나타내 phage 간 증식 특성의 차이가 확인되었다. 화학·환경적 안정성 평가 결과, EcBP-1과 EcBP-2는 pH 2~10에서, SsBP-1은 pH 4~10에서 비교적 안정하였으나, pH 12에서는 모두 활성이 완전히 소실되었다. Salinity 조건에서는 3종의 phage 모두 1~3%에서 비교적 안정하였으며, 10%에서 활성이 가장 크게 감소하였고 실제 해수와 3%와 유의적 차이를 보이지 않아 해수에 함유된 기타 성분들이 bacteriophage의 활성에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. Temperature 안정성 평가에서 EcBP-1과 SsBP-1은 0 ~ 10°C에서 안정하였으나, EcBP-2는 5°C에서 감소가 가장 크게 나타났다. Ethanol 처리 결과 phage 간 내성 차이가 뚜렷하게 나타났으며, 특히 EcBP-1은 농도 의존적으로 활성이 감소한 반면 SsBP-1은 50% 이하에서 비교적 높은 안정성을 보였다. 굴 표면에서의 E. coli 저감 효과 평가 결과, EcBP-1과 SsBP-1은 8시간 이후, EcBP-2는 12시간 이후 감소가 시작되었으며, 각각 최대 약 1.4, 1.3, 1.0 log CFU/g의 저감 효과를 나타냈다. 반면 phage cocktail은 단일 phage보다 빠르고 큰 저감 효과를 보여 4시간부터 감소가 관찰되었고, 24시간 후 약 2.0 log CFU/g의 가장 큰 저감 효과를 보였다. 본 연구 결과는 분리한 bacteriophage들이 뚜렷한 생물학적·화학적 특성을 지니며, 굴 표면의 E. coli 저감에 효과적으로 활용될 수 있음을 보여주며, 특히 phage cocktail의 우수한 제어 효과는 패류의 안전성 확보를 위한 실용적 생물학적 제어 전략으로서의 가능성을 제시한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Escherichia coli, a representative member of the Enterobacteriaceae family, includes several pathogenic strains capable of causing gastrointestinal illnesses such as diarrhea, abdominal pain, and vomiting. Enteric E. coli transmitted through contaminated water or food is frequently detected in polluted water sources, vegetables, fruits, and particularly in aquatic products such as bivalves, which are easily affected by surrounding water quality. E. coli contamination in food can occur through human or animal feces, contaminated equipment, or food-handling environments, and such cross-contamination is a major cause of foodborne outbreaks. E. coli – associated diarrheal diseases remain highly prevalent worldwide and can lead to severe dehydration and prolonged diarrhea, especially in infants, the elderly, and immunocompromised individuals. Therefore, in this study, three bacteriophages with specificity toward E. coli ATCC 25922 and Shigella sonnei KCTC 12004—designated EcBP-1, EcBP-2, and SsBP-1—were isolated from seawater collected in Mokpo and Muan, Korea. The biological and chemical characteristics of the isolated phages were analyzed, and their ability to reduce E. coli contamination on oyster surfaces was evaluated. Host range analysis revealed that EcBP-1 infected E. coli ATCC 25922 and two oyster-derived E. coli strains, EcBP-2 infected five additional oyster-derived strains, and SsBP-1 infected E. coli, S. sonnei, and four oyster-derived E. coli strains. Morphological analysis classified EcBP-1 and EcBP-2 as members of the Myoviridae family, while SsBP-1 belonged to the Siphoviridae family. One-step growth analysis showed that EcBP-1 exhibited a latent period of approximately 25 min and a burst size of 1.4 log PFU/mL, whereas EcBP-2 and SsBP-1 displayed latent periods of approximately 15 min and burst sizes of 1.7 log PFU/mL, indicating distinct replication characteristics among the phages. Stability tests demonstrated that EcBP-1 and EcBP-2 were stable between pH 2–10, while SsBP-1 was stable between pH 4–10 all phages lost activity completely at pH 12. All three phages maintained stability at salinity levels of 1–3%, with the greatest reduction in activity observed at 10%. No significant difference was found between 3% salinity and natural seawater, suggesting minimal influence of other seawater components on phage activity. In temperature stability assays, EcBP-1 and SsBP-1 remained stable at 0–10°C, whereas EcBP-2 showed the greatest reduction at 5°C. Ethanol stability varied among the phages EcBP-1 showed concentration-dependent inactivation, whereas SsBP-1 remained relatively stable at concentrations up to 50%. On oyster surfaces, EcBP-1 and SsBP-1 began reducing E. coli levels after 8 hr, and EcBP-2 after 12 hr, with maximum reductions of 1.4, 1.3, and 1.0 log CFU/g, respectively. In contrast, the phage cocktail exhibited earlier and stronger antibacterial activity, showing reductions from 4 hr and achieving a maximum decrease of approximately 2.0 log CFU/g after 24 hr. Collectively, these findings demonstrate that the isolated bacteriophages possess distinct biological and chemical properties and can be effectively applied to reduce E. coli contamination on oyster surfaces. Furthermore, the superior performance of the phage cocktail highlights its potential as a practical biological control strategy for enhancing the microbial safety of bivalves.

목차 (Table of Contents)

• 제 1 장 서 론 1
• 제 2 장 재료 및 방법 4
• 1. 사용 균주 및 배양 조건 4
• 2. 환경 시료로부터 Bacteriophage 분리 5
• 2. (1) 해수에서의 Bacteriophage 분리 5
• 2. (2) 패류에서의 Bacteriophage 분리 5
• 2. (3) Bacteriophage stock suspension 제조 6
• 3. Host range test 7
• 4. TEM을 이용한 Bacteriophage의 형태학적 특성 분석 8
• 5. Bacteriophage의 One step growth curve 8
• 6. Bacteriophage의 Stability 8
• 6. (1) pH stability 9
• 6. (2) Salinity stability 9
• 6. (3) Temperature stability 9
• 6. (4) Ethanol stability 9
• 7. Bacteriophage를 이용한 굴에서의 Escherichia coli 제어 11
• 7. (1) Bacteria stock 제조 11
• 7. (2) Bacteriophage cocktail 제조 11
• 7. (3) 재료 및 실험방법 11
• 8. 통계처리 12
• 제 3 장 결과 및 고찰 13
• 1. 환경 시료로부터 Bacteriophage 분리 13
• 2. Host range test 22
• 3. TEM을 이용한 Bacteriophage의 형태학적 특성 분석 24
• 4. Bacteriophage의 One step growth curve 29
• 5. Bacteriophage의 Stability 33
• 5. (1) pH stability 33
• 5. (2) Salinity stability 37
• 5. (3) Temperature stability 41
• 5. (4) Ethanol stability 49
• 6. Bacteriophage를 이용한 굴에서의 Escherichia coli 제어 53
• 제 4 장 결 론 57
• 참고문헌 60
• 영문초록 68