유전체 편집을 위한 Cas12f 변이체의 새로운 non-canonical PAM 규명

국문 초록 (Abstract)

CRISPR/Cas system 은 유전자교정이 가능하다는 장점이 있어 여러 분야에서
널리 연구되고 있다. 지금까지 Class 2 Type V-F 에 속하는 다양한 유형의
Cas12f 가 발견되었으며, 본 연구에서는 Cas12f ortholog 중 하나인 Un1Cas12f1
nuclease 의 특성을 규명하고자 하였다. Un1Cas12f1 은 Cas9 과 Cas12 (~950-
1400 amino acids)보다 작은 형태 (529 amino acids)로 구성되어 생체 내 전달이
비교적 용이하다는 장점이 있다. 그러나 Un1Cas12f1 의 canonical PAM 이 5’-
TTTR-3’으로 제한적이기 때문에 본 연구에서는 Un1Cas12f1 의 noncanonical PAM 을 규명하고자 하였다. Un1Cas12f1 이 5’-TCCN-3’, 5’-
TTCN-3’, 5’-TCTN-3’, 5’-CTCN-3’ non-canonical PAM 을
인지하지는 지의 여부를 확인한 결과, Un1Cas12f1 은 5’-TTTR-3’ canonical
PAM 이외에도 5’-TCTA-3’과 5’-TTCG-3’ non-canonical PAM 을
인지하여 높은 유전자 교정을 유도했으며, 이에 따라 더욱 다양한 target 에서
genome editing 이 가능함을 확인하였다. 또한, Un1Cas12f1 은 1 개의 U6
프로모터에서 2 개 이상의 gRNA 를 연결하여 발현시켰을 때 2 개 이상의 gRNA 가
동시에 작동되어 여러 표적부위에서 multiplexed genome editing 이 유도되는 것을
확인하였다. 이러한 특성을 적용하여 Un1Cas12f1 이 cancer cells 내 발암변이
특이적 allele 에 존재하는 canonical PAM 과 non-canonical PAM 을 동시에
인지하여 발암변이 특이적 유전자 교정이 가능하다는 것을 확인하였다. 따라서 본
연구를 통해 규명한 Un1Cas12f1 의 다양한 PAM 인지 기능 및 multiplexed
genome editing 기능을 기반으로 암 치료제 개발 가능성을 기대할 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 11
• 1.1. CRISPR/Cas system 11
• 1.2. Base editor 12
• 1.3. Cancer therapy 14
• 1.4. Cas12f 15
• 1.5. 연구 목적 16
• II. 실험 방법 18
• 2.1 기기 18
• 2.2 시약 18
• 2.3 Single guide RNA plasmid 제작 19
• 2.4 Multiplexed guide RNA plasmid 제작 21
• 2.5 Cell lines 및 cell culture 23
• 2.6 Transfection 및 genomic DNA extraction 24
• 2.7 차세대 염기서열 분석을 위한 library 제작 24
• 2.8 데이터 분석 및 통계적 분석 25
• Ⅲ. 실험 결과 36
• 3.1. Vector structure 및 gRNA length 차이 별 효율 비교 36
• 3.2. Un1Cas12f1 의 non-canonical PAM 인지 확인 39
• 3.3. Un1Cas12f1 에 의한 dual gRNA 의 활성도 확인 42
• 3.4. Un1Cas12f1 에 의한 multiplexed gRNA 의 활성도 확인 46
• 3.5. Cancer cells 내 Un1Cas12f1 의 oncogenic mutant specific genome editing 확인 50
• 3.6. TaRGET-ABE 를 통한 non-canonical PAM 의 인지 효율 확인 57
• Ⅳ. 결론 및 고찰 60
• Ⅴ. 참고 문헌 62