Ameliorative effect of Annona muricata (graviola) extract on hyperglycemia induced hepatic damage in type 2 diabetic mice

국문 초록 (Abstract)

Annona muricata는 Annonaceae계열의 상록 식물로 주로 열대 및 아열대 지역에 분포하며 보편적으로 그라비올라 (graviola)라고 불린다. Annona muricata의 주요 생리 활성 성분은 Annonaceous acetogenin으로, 항암 및 항당뇨 효과가 보고되고 있다. 이 연구에서는 50% 에탄올에서 추출한 Annona muricata 잎 추출물(AME)이 당뇨병 설치류 모델의 간 손상에 미치는 보호 효과를 조사했다. 제 2형 당뇨는 C57BL/6 수컷 마우스에서 고지방 식이와 2회의 스트렙토조토신(streptozotocin) 복강 내 투여 (60mg/kg BW)를 통해 유도되었다. 당뇨병 마우스는 9주 동안 경구 투여를 통해 매일 AME (50 또는 100mg/kg BW)를 섭취하였다. 실험 기간 동안 모든 마우스의 체중, 음식 섭취량 및 공복 혈당 수준을 일주일에 한 번 측정했다. 이외에도 당화혈색소 및 간 지질 프로필, 아스파르테이트 아미노전달효소 (aspartate amino-transferase, AST) 및 알라닌 아미노전이효소 (alanine amino-transferase, ALT) 와 같은 간 효소 수치를 측정했다. 더하여, 인슐린 저항성 항상성모델평가 (homeostatic model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)를 진행하였다. 자가 포식, 에너지 대사 및 인슐린 신호와 관련된 바이오 마커를 조사하여 고혈당으로 인한 간 손상에 대한 Annona muricata 잎 추출물의 효과를 확인했다. 결과적으로, DMC군과 비교하였을 때 LAM군과 HAM군 모두에서 insulin receptor substrate 1 (IRS-1)의 발현 증가 뿐 아니라 glucose transporter 2 (GLUT2)의 전위 증가가 나타났다. 특히 LAM군에서 DMC군에 비해 유의적으로 공복 혈당, 당화혈색소, 포도당 내성, 인슐린 저항성 및 지질 프로파일의 수준이 감소했다. AME는 산화적 스트레스 감소를 통해 관련 인자 (nuclear factor erythroid 2 related factor 2, NAD(P)H quinone dehydrogenase 1)의 발현을 감소시켰다. 특히 산화적 스트레스 저하 효과는 4-hydroxy-nonenal (4-HNE)와 protein carbonyls 감소에서도 나타났다. AME 보충은 당뇨 마우스에서 지방 포식 관련 바이오 마커 (phosphorylated AMP-activated protein kinase; pAMPK, phosphorylated mammalian target of rapamycin/mTOR ratio, microtubule-associated protein 1 light chain 3)의 상향 조절을 통해 간 조직 내 지방구가 과잉으로 축적되는 것을 크게 개선했다. 또한, AME 보충은 당뇨병 마우스에서 발생하는 비정상적인 간 지질 대사 (fatty acid synthase, sterol regulatory element-binding protein 1, CCAAT-enhancer-binding proteins α, peroxisome proliferator-activated receptor γ; PPARγ, carnitine palmitoyl-transferase 1A, PPARα) 및 에너지 대사 (pAMPK, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α)를 개선했다. 종합해보면, 이 연구는 AME가 제 2형 당뇨병에서 에너지 대사 및 자가 포식과 관련된 인슐린 신호 전달을 조절함으로써 간 손상 예방 물질로 활용될 수 있음을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Annona muricata is an evergreen plant, mainly distributed in tropical and subtropical regions. Annona muricata contains the major bioactive component, acetogenin, which shows anticancer and antidiabetic effects. In this study, we investigated the protective effect of Annona muricata extracts (AME) extracted in 50% ethanol on hepatic damage in diabetic mice. Diabetes was induced by a high fat diet with two times streptozotocin (STZ) injection (60 mg/kg BW) in C57BL/6 male mice. The diabetic mice were daily administered with AME (50 or 100 mg/kg BW) by gavage for 9 weeks. Body weights, food intakes and FBG levels in all mice were measured once a week. Plasma levels of HbA1c and hepatic biochemistry including lipid profiles, aspartate amino-transferase (AST) and alanine amino-transferase (ALT) were measured. Biomarkers related to energy metabolism and insulin signaling were examined to identify the effect of Annona muricata on hyperglycemia induced hepatic damage. AME supplementation reduced levels of FBG, HbA1c, glucose tolerance, homeostatic model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) and hepatic lipid profiles as well as insulin receptor substrate 1 (IRS-1) accompanied by increased translocation of glucose transporter 2 (GLUT2) in diabetic mice. AME showed the effect of reducing oxidative stress by low expression of related factors (nuclear factor erythroid 2 related factor 2, NAD(P)H quinone dehydrogenase 1). In particular, levels of 4-hydroxy-nonenal (4-HNE) and protein carbonyls were decreased. AME supplementation significantly improved hepatic morphology demonstrated by lipid droplets along with upregulation of lipophagy related biomarkers (phosphorylated AMP-activated protein kinase; pAMPK, phosphorylated mammalian target of rapamycin/mTOR ratio, microtubule-associated protein 1 light chain 3) in diabetic mice. Moreover, AME supplementation ameliorated hepatic lipid metabolism (fatty acid synthase, sterol regulatory element-binding protein 1, CCAAT-enhancer-binding proteins α, peroxisome proliferator-activated receptor γ; PPARγ, carnitine palmitoyl-transferase 1A, PPARα) and energy metabolism (pAMPK, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α) in diabetic mice. Taken together, this study suggested that AME could be helpful to prevent hepatic abnormality by regulation of insulin signaling associated with energy metabolism and autophagy in diabetes.

목차 (Table of Contents)

• 1. INTRODUCTION 1
• 2. LITERATURE REVIEW 3
• 2.1. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus (T2DM) 3
• 2.2. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in T2DM 3
• 2.3. Insulin resistance and lipid dysregulation in T2DM 4
• 2.4. Crosstalk among insulin signaling, energy metabolism, and autophagy in T2DM 5
• 2.5. Effects of Annona muricata (graviola) on metabolic diseases 6
• 3. SPECIFIC AIMES 8
• 4. MATERIALS AND METHODS 9
• 4.1. Preparation of Annona muricata extract (AME) 9
• 4.2. Animals and diabetes induction 9
• 4.3. Experimental design 10
• 4.4. Oral glucose tolerance test 10
• 4.5. Plasma hemoglobin A1c level 11
• 4.6. Homeostatic model assessment for insulin resistance level 11
• 4.7. Hepatic damage related markers 11
• 4.8. Hepatic lipid profiles 11
• 4.9. Histological analysis 11
• 4.10. Western blot assay 12
• 4.11. Statistical analysis 13
• 5. RESULTS 14
• 5.1. Effect of AME on body weight, liver weight and diet intake in type 2 diabetes mice 14
• 5.2. Effect of AME on fasting blood glucose and hemoglobin A1c in type 2 diabetes mice 16
• 5.3. Effect of AME on glucose tolerance and insulin resistance in type 2 diabetes mice 18
• 5.4. Effect of AME on hepatic damage in type 2 diabetes mice 20
• 5.5. Effect of AME on hepatic morphology and lipid profiles in type 2 diabetes mice 22
• 5.6. Effects of AME on insulin signaling in type 2 diabetes mice 24
• 5.7. Effects of AME on hepatic oxidative stress in type 2 diabetes mice 26
• 5.8. Effects of AME on energy metabolism in type 2 diabetes mice 28
• 5.9. Effects of AME on autophagy in type 2 diabetes mice 30
• 5.10. Effects of AME on lipid metabolism in type 2 diabetes mice 32
• 6. DISCUSSION 34
• 7. CONCLUSION 38
• 8. REFERENCE 39
• 9. ABSTRACT 45
• 10. 국문 초록 47