동물대체시험법을 이용한 창이자 추출물의 피부 감작성 및 자극성 평가

국문 초록 (Abstract)

동물대체시험법을 이용한 창이자 추출물의 피부 감작성 및 자극성 평가
이 혜 민
명지대학교 대학원 식품영양학과
지도교수 황 진 아
창이자(Xanthii Fructus)는 한국, 중국, 일본 등 아시아 전역에 분포하는 도꼬마리의 열매로, 전통적으로 염증성 질환 및 궤양성 피부질환에 대한 효능이 보고된 약재이며 현재 대한민국약전에는 중국산 창이자가 등재되어 한약재로 사용되고 있으나 국내 자원 활용 확대 및 향후 의약품 소재화 가능성을 고려할 때 국산 창이자의 표준화 및 기능성 검증을 위한 과학적∙체계적 연구가 필요한 상황이다. 한편, 화장품의 안전성 평가에서 동물실험 규제가 강화됨에 따라 동물대체시험법(Alternative Test Methods) 기반의 평가체계가 국제적으로 요구되고 있다.
본 연구에서는 HaCaT 인간 각질형성세포(HaCaT human keratinocyte) 및 피부재현모델(Reconstructed Human Epidermis, RHE)을 활용하여 창이자 추출물의 피부 감작성 및 자극성을 평가하고, 화장품 원료로서의 안전성과 가능성을 검증하고자 하였다. HaCaT 세포를 이용한 감작성 평가에서 창이자 처리군의 자극지수(Stimulation Index, SI)는 OECD 기준(SI < 3)을 충족하여 감작성 유발 가능성이 낮음을 보여주었다. 감작성의 분자 개시 단계(Molecular Initiating Event, MIE)를 평가하는 Direct Peptide Reactivity Assay(DPRA, OECD TG 442C)에서도 창이자 추출물은 cysteine/lysine(≥6.38%) 모델 기준치 미만의 낮은 펩타이드 소실률을 보여 비감작성 물질(non-sensitizer)로 분류되었다. 또한 RHE 기반 in vitro 피부 자극성 평가(OECD TG 439)에서 창이자 추출물은 모든 농도에서 세포독성
을 나타내지 않아 비자극성(non-irritant)으로 확인되었다.
추가적으로, 네트워크 기반 in silico 분석을 통해 창이자의 주요 생리활성 성분과 피부 염증 관련 경로 간의 연관성을 평가한 결과, IL6, TNF, JUN 등 면역 반응 조절 유전자와의 연관성이 확인되었으며 TP53, JUN, TNF, IL6 등이 핵심 허브 유전자로 도출되었다. Network pharmacology에서 예측된 주요 표적의 실험적 검증을 확인하기 위해 IL-6 mRNA 발현을 RT-PCR로 분석한 결과, 창이자 추출물 처리군에서 IL-6 발현은 시료 및 농도에 따라 변화하는 것으로 나타났다.
결론적으로, 본 연구는 국산 및 중국산 창이자 추출물이 비감작성·비자극성을 나타내는 안전한 소재이며, 염증 조절 작용을 포함한 피부 개선 기전을 보유함을 확인하였다. 본 연구 결과는 향후 창이자를 천연물 기반 기능성 화장품 원료로 활용하기 위한 과학적 근거를 제공하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Evaluation of Skin Sensitization and Irritation Potential of Xanthi Fructus Extract Using Alternative Test Methods
Lee Haemin
Department of Food and Nutrition
Graduate School, Myongji University
Directed by Professor Hwang Jinah
Xanthii Fructus (XF) is the fruit of Xanthium strumarium L., distributed widely across Asia including Korea, China, and Japan. It has traditionally been used to treat inflammatory and ulcerative skin disorders. In the Korean Pharmacopoeia, only the Chinese Xanthii Fructus (XF-C) is registered as a medicinal material. However, considering the potential for resource diversification and future drug development, systematic scientific research on the standardization and functional evaluation of domestically produced XF is required. Meanwhile, international regulations on cosmetic safety assessment increasingly emphasize the use of alternative test methods to replace animal testing.
In this study, the skin sensitization and irritation potentials of XF extract were evaluated using both human keratinocytes (HaCaT) and reconstructed human epidermis (RHE) models to verify its safety and applicability as a cosmetic ingredient. In the sensitization assessment using HaCaT cells, the stimulation index (SI) of the extract-treated groups was below the OECD threshold (SI < 3), indicating a low potential for skin sensitization. In addition, in the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA, OECD TG 442C), which evaluates the molecular initiating event (MIE) of skin sensitization, XF extracts exhibited low peptide depletion rates below the threshold value of the cysteine/lysine (≥ 6.38%) model and were classified as nonsensitizers. Furthermore, in the RHE-based in vitro skin irritation test (OECD TG 439), extract showed no cytotoxicity at any tested concentration and was classified as non-irritant.
Additionally, network-based in silico analysis was conducted to evaluate the associations between the major bioactive compounds of XF and skin inflammation-related pathways. The results revealed associations with immune response–regulating genes such as IL6, TNF, and JUN, and TP53, JUN, TNF, and IL6 were identified as core hub genes. To experimentally verify the key targets predicted by network pharmacology, IL-6 mRNA expression was analyzed by RT-PCR, and the results showed that IL-6 expression in XF extracts treated groups varied depending on the sample and concentration.
In conclusion, both Korean and Chinese XF extracts were found to be safe, exhibiting non-sensitizing and non-irritant properties, while also possessing anti-inflammatory and skin-improving mechanisms. These findings provide a scientific basis for the future use of XF as a natural, functional cosmetic ingredient.

목차 (Table of Contents)

• 그림목차 ⅲ
• 표목차 ⅳ
• 국문초록 ⅴ
• 제 1 장 서론 1
• 1.1 연구 배경 1
• 1.1.1 창이자 연구의 필요성 1
• 1.1.2 피부의 구조 및 기능 4
• 1.1.3 동물대체모델의 필요성 7
• 1.1.4 피부 감작성 10
• 1.1.5 피부 자극성 13
• 1.1.6 Network pharmacology 16
• 1.2 연구 목적 18
• 제 2 장 재료 및 방법 19
• 2.1 시료의 추출 19
• 2.2 세포 생존율 측정 21
• 2.3 피부 감작성 측정 21
• 2.3.1 IL-6 단백질 발현 21
• 2.3.2 IL-6 mRNA 발현 22
• 2.3.3 Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) 25
• 2.4 피부 자극성 측정 26
• 2.4.1 피부재현모델을 이용한 피부 자극성 측정 26
• 2.5 Network pharmacology 28
• 2.6 통계 분석 29
• 제 3 장 결과 30
• 3.1 창이자 추출물의 세포 생존율 평가 30
• 3.2 창이자 추출물의 피부 감작성 평가 32
• 3.2.1 IL-6 변화를 통한 감작성 평가 32
• 3.2.2 Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) 37
• 3.3 창이자 추출물의 피부 자극성 평가 41
• 3.3.1 피부재현모델을 이용한 세포 생존율 평가 41
• 3.4 Network pharmacology 44
• 3.4.1 Network pharmacology 44
• 3.4.2 Network pharmacology 검증 49
• 제 4 장 고찰 51
• 제 5 장 결론 58
• 참고문헌 61
• Abstract 68