항암제 저항성 획득에 따른 FGFR1-YES1 신호 활성화 기반 비소세포폐암 침윤성 조절 기전 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor) is a receptor tyrosine kinase that regulates various physiological functions. In normal cells, it plays an essential role in tissue development and homeostasis. However, in the tumor microenvironment, it can become abnormally activated through gene amplification, overexpression, or mutations. Upon binding with FGF, FGFR undergoes conformational changes that induce phosphorylation in the intracellular kinase domain, thereby activating various downstream signaling pathways such as MAPK, PI3K/Akt, and JAK/STAT. These cascades regulate cellular processes such as proliferation, survival, differentiation, angiogenesis, and metastasis. Hyperactivation of FGFR leads to sustained proliferative and survival signaling through its downstream pathways, including Akt, STAT, and ERK, which contributes to tumor growth and the development of resistance to anticancer drugs.
In this study, we utilized the EGFR-mutant non-small cell lung cancer (NSCLC) cell line H1975. When comparing the parental H1975 cells and their osimertinib-resistant derivative H1975/OR, we observed increased expression of all FGFR isoforms (FGFR1–4) in the resistant cells. Protein levels of FGFR1 and its downstream signaling molecules were also elevated. Moreover, while Src family kinases have been suggested as downstream regulators of FGFR1 in drug-resistant cancer models, the underlying mechanisms remain poorly understood. To investigate this, we inhibited FGFR1 using siRNA and a pharmacological FGFR inhibitor and analyzed the expression of YES1 and its downstream effectors. As a result, suppression of FGFR1 led to a reduction in the expression of YES1 and its downstream components YAP and TEAD.
To further examine the effect of FGFR1 inhibition on EMT (epithelial-mesenchymal transition), we analyzed the expression of key EMT markers. Treatment with FGFR1 siRNA or the FGFR inhibitor reduced mRNA levels of Snail, Slug, and Vimentin. To evaluate the functional impact of FGFR1 inhibition on cell behavior, we assessed cell viability, migration, and clonogenic potential in H1975/OR cells. Both siRNA-mediated knockdown and pharmacological inhibition of FGFR1 reduced cell viability and colony-forming ability in a dose-dependent manner. Migration assays revealed that FGFR1 suppression also impaired cell motility. Based on the finding that FGFR1 suppression attenuates YES1–YAP activity, we further examined whether inhibiting YAP alone would mimic these effects. Treatment with the YAP degrader verteporfin significantly reduced cell growth and led to decreased mRNA expression of EMT markers Snail, Slug, and Vimentin in a dose-dependent manner.
Additionally, we observed that FGFR1 inhibition resulted in reduced expression of Nrf2 and its downstream antioxidant genes NQO1, HO-1, and GCLC. Nrf2 is a well-known regulator of antioxidant responses and plays a critical role in tumor progression and the acquisition of drug resistance. To explore whether additional defense mechanisms exist in osimertinib-resistant H1975/OR cells, we examined the expression of FoxO3a. Compared to parental cells, H1975/OR cells exhibited elevated levels of FoxO3a, including its phosphorylated form at Ser7. Upon FGFR1 suppression, both total and phosphorylated FoxO3a levels decreased in a dose-dependent manner, and nuclear fractionation analysis confirmed that nuclear localization of FoxO3a was diminished.
Collectively, our findings demonstrate that FGFR1 and its downstream signaling molecules are upregulated in osimertinib-resistant H1975/OR cells harboring EGFR mutations. Inhibition of FGFR1 not only suppresses these signaling cascades but also reduces cell viability, motility, and colony formation capability. Furthermore, FGFR1 suppression attenuates the activity of the YES1–YAP axis and reduces antioxidant signaling through Nrf2 and stress response through FoxO3a. These results suggest that FGFR1 supports tumor cell survival via multiple mechanisms and that targeting FGFR1 may represent an effective therapeutic strategy to overcome drug resistance in non-small cell lung cancer.

국문 초록 (Abstract)

폐암은 크기와 모양에 따라 세포가 작은 경우 소세포폐암(small cell lung cancer, SCLC), 작지 않은 경우 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)으로 분류된다. 비소세포폐암의 경우 전체 폐암 중 약 85%를 차지하는 가장 흔한 유형의 폐암이며, 이 중 상당수는 EGFR 유전자에 돌연변이를 가지고 있고 이는 종양의 성장과 생존을 유도하는 주요한 원인으로 알려져 있다. 이러한 돌연변이를 표적으로 하는 억제제들이 개발되고 효과를 보였으나 대부분 수개월 내에 내성을 보이며 치료 효과가 감소하는 한계점이 존재한다.
FGFR1(Fibroblast Growth Factor Receptor 1)은 세포의 성장, 생존, 이동, 분화에 관여하는 수용체 타이로신 카이네이즈(receptor tyrosine kinase)로, 다양한 암종에서 종양의 진행 및 내성에 기여하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 EGFR을 타겟으로 하는 항암제에 내성을 갖는 폐암 세포주에서 FGFR에 의존적인 신호를 표적으로 하는 전략이 내성을 극복하고 치료 효과를 향상시킬 수 있는 접근법인지 판단하고자 하였다. EGFR 표적 항암제 osimertinib에 내성을 가진 H1975/OR(H1975/Osimertinib resistant) 세포에서 모세포보다 FGFR1의 발현과 FGFR의 인산화가 증가되어 있고 이에 따라 하위 신호들 또한 증가되어 있음을 확인할 수 있었다. H1975/OR 세포는 colony 생성 능력 또한 모세포보다 뛰어난 것을 확인할 수 있었으며 FGFR1 저해 시 그 능력이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. H1975/OR 세포에서 FGFR1을 저해시켰을 때 하위 신호 전달 과정인 Akt, Stat 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며 YES1과 그의 하위 신호전달 과정인 YAP1의 인산화가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. FGFR1을 저해함에 따라 세포의 생존율과 이동성 또한 감소됨을 확인할 수 있었고 EMT 관련 유전자인 Snail, Slug, Vimentin의 mRNA 발현 수준과 항산화 관련 유전자인 Nrf2, GCLC, NQO1, HMOX1의 mRNA 발현 또한 감소함을 확인할 수 있었다. FGFR 저해제인 AP24534를 H1975/OR 세포에 처리하였을 때 단독처리군에 비해 osimertinib과 병용 처리했을 때 상승적인 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. AP24534를 처리했을 때 YES1과 YAP1 단백질 발현이 감소함을 볼 수 있었고 Nrf2 관련 단백질 발현의 감소와 EMT marker의 mRNA 발현 수준의 감소를 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과들을 종합하여 볼 때 EGFR 돌연변이를 갖는 비소세포폐암 세포에서 FGFR1을 억제함으로써 암세포의 생존, 전이를 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 이를 타겟으로 하는 전략이 표적 치료제의 내성을 극복하고 비소세포폐암을 포함한 다양한 암종에서 치료 효과를 향상시킬 수 있을 것이라는 가능성을 제시하는 바이다.

목차 (Table of Contents)

• 1. 서론 1
• 1.1 연구 배경 1
• 1.2 FGF 신호전달 3
• 1.3 종양에서 FGFR1의 역할 5
• 1.4 약물 저항성 모델에서 YAP/TAZ의 역할 8
• 2. 재료 및 실험 방법 11
• 2.1 세포 배양 조건 및 세포 수집 11
• 2.2 세포 약물 처리 조건 및 FGFR1 transfection 13
• 2.3 단백질 추출 14
• 2.4 세포질 및 핵 단백질 추출 15
• 2.5 Western blot analysis 17
• 2.6 Cell viability assay 18
• 2.7 RNA 분리 및 RT-qPCR 19
• 2.8 Wound migration assay 22
• 2.9 Clonogenic assay 23
• 2.10 Immunocytochemistry analysis 24
• 2.11 시약 및 기구 25
• 3. 결과 27
• 3.1 H1975/P와 H1975/OR 세포 간 osimertinib 저항성 및 YES1-YAP1 신호 활성 비교 27
• 3.2 H1975/P 및 H1975/OR 세포 간 FGFR의 활성화에 따른 하위 신호전달 차이 분석 30
• 3.3 Osimertinib 저항성 H1975/OR 세포에서 FGFR1 억제가 YES1과 하위 신호전달에 미치는 영향 33
• 3.4 H1975/OR 세포에서 FGFR1 저해가 EMT 관련 유전자 발현에 미치는 영향 35
• 3.5 FGFR 저해제의 처리에 따른 H1975/OR 세포의 생존 및 colony 형성 능력 변화 37
• 3.6 FGFR1 억제에 따른 H1975/OR 세포의 생존, 이동 및 colony 형성 능력 변화 39
• 3.7 H1975/OR 세포에서 YAP 억제가 EMT 관련 유전자 발현에 미치는 영향 41
• 3.8 H1975/OR 세포에서 FGFR1 저해가 Nrf2 매개 항산화 유전자 발현에 미치는 영향 44
• 3.9 Osimertinib 저항성 세포에서 FoxO3a의 전사적 조절 가능성과 FGFR1-Nrf2 신호 연계성 탐색 47
• 4. 고찰 50
• 참고문헌 54
• Abstract 60