커피실버스킨 유래 다당에 의한 면역증진활성과 면역억제 모델에서의 경구투여 효과

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 커피 산업의 대표적 부산물인 커피실버스킨으로부터 분리 및 정제하여 얻은 다당을 이용하여 in vitro 면역증진 효과와 면역 억제 mouse 모델에서의 경구 투여 효과를 평가하고자 하였다. 또한, 이러한 생리활성을 책임지는 다당의 구조 특성을 규명함으로써, 면역 증강 작용을 담당하는 활성 본체를 밝히는 것을 목표로 하였다.
커피실버스킨에서 pectin 다당을 얻기 위해 건조 시료를 100℃에서 열수 추출을 행하고 저분자 부분을 제거하여 조다당 획분인 CSP를 얻었다. 그 후, homogalacturonan(HG) 영역을 제거하기 위해서 pectinase를 처리하고, 에탄올을 가하여 용해되어있는 다당을 침전시킨 뒤, 이를 동결 건조하여 효소 처리 다당 획분 CSPE를 얻었다. CSPE의 화학적 특성을 평가한 결과 중성당, 산성당, 및 소량의 폴리페놀로 구성되어 있었으며, 구성당 조성은 rhamnose (19.8%), arabinose (7.9%), galactose (20.8%), galacturonic acid (38.9%)로 주로 구성되어 있었다. CSPE의 분자량 분포도를 확인한 결과 HG 영역의 가수분해가 정상적으로 진행되었음을 알 수 있었으며, CSP에 비해 CSPE의 산성당 함량이 감소된 것을 통해 HG 영역이 효과적으로 제거되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 다양한 생리활성능을 평가하기 위해 대식세포에 대해 증식능과 cytokine 분비능을 측정한 결과 세포 독성이 없는 것으로 관찰되었으며, 우수한 cytokine 분비능을 보였다.
효소 처리 획분 CSPE의 활성 본체를 규명하기 위해 Sephadex G-75를 활용한 size exclusion chromatography로 분자량이 상이한 정제 다당 CSPE-Ⅰ, CSPE-Ⅱ, CSPE-Ⅲ 및 CSPE-Ⅳ로 분획하였다. 커피실버스킨으로부터 조제한 정제 다당 획분 중 특히 CSPE-Ⅰ은 rhamnose (11.7%), arabinose (14.1%), galactose (34.1%), galacturonic acid (15.6%)로 구성되어 있었으며. 이는 면역 활성이 우수하다고 보고된 rhamnogalacturonan (RG)-Ⅰ형 다당으로 추정되었다. 한편, mouse 복강 유래 대식세포의 cytokine 분비 능력을 측정한 결과, 효소 처리 및 정제를 거칠수록 cytokine 분비량이 증가했으며, CSPE-Ⅰ이 가장 우수한 활성을 나타냈다. 이는 효소 처리를 통해 비활성 영역인 HG이 제거되고, 활성 영역인 RG형 다당이 상대적으로 농축되었기 때문으로 판단된다. 이를 통해 커피실버스킨 유래 다당의 면역증진 활성은 주로 CSPE-Ⅰ에 의한 것으로 판단되었다.
Mouse 유래 대식세포주 RAW 264.7을 이용하여 CSPE-Ⅰ에 의한 cytokine과 NO의 분비량을 측정하였다. 그 결과 농도 의존적인 cytokine 분비능을 확인할 수 있었으며, RAW 264.7 세포의 탐식능과 IL-6, iNOS, TNF-α 유전자 발현 증가를 유도함을 확인하였다. 이를 매개하는 단백질의 활성화를 확인하기 위해 Western blotting을 수행한 결과, CSPE-Ⅰ은 MAPK 경로 중 ERK와 P38의 인산화가 뚜렷하게 증가하여, CSPE-Ⅰ이 세포 내 MAPK 경로를 부분적으로 활성화하는 것으로 확인되었다. 또한, 염증과 면역 반응 조절에 중요 NF-κB 경로에서는 IκBα의 분해가 확인되어, p65의 핵 내 이동 및 전사 활성화가 일어날 가능성을 시사하였다.
In vivo 면역 조절 효과를 확인하기 위해 cyclophosphamide (CTX)를 이용하여 면역억제를 유도한 mouse 모델을 사용하였다. 증류수, 구름버섯 유래 베타글루칸인 시판 면역증강제 Krestin (100mg/kg) 및 CSPE-Ⅰ을 세 가지 농도로 나누어 6개의 그룹에 각각 15일간 경구로 투여하였으며, 투여 시작 6일째부터 3일간 NT군을 제외한 5개의 군에 CTX를 복강 내 주사하여 면역 억제를 유도하였다: NT (증류수), NT (증류수+CTX), PC (Krestin+CTX), CL (25 mg/kg of CSPE-Ⅰ+CTX), CM (50 mg/kg of CSPE-Ⅰ+CTX), CH (100 mg/kg of CSPE-Ⅰ+CTX).
CTX로 유도된 면역억제 mouse 모델에서 임상 증상을 관찰한 결과, NT 군 대비 NC의 체중이 급격히 감소한 반면, PC 군에서는 일부 완화되었으며, CSPE-Ⅰ 고농도 투여군 (CH)에서 가장 큰 회복이 관찰되었다. 신체의 중요한 림프 기관인 흉선과 비장은 면역력이 감소되면 면역세포의 수가 줄어들어 크기가 위축되는 특징을 보인다. CSPE-Ⅰ이 이러한 면역 억제 상태를 완화할 수 있는지를 확인하기 위해 흉선과 비장의 무게와 크기 변화를 측정하였다. 그 결과, CTX를 투여한 군에서는 NT 군에 비해 유의하게 감소하였고, CSPE-Ⅰ을 투여한 군에서는 용량 의존적으로 두 기관의 무게와 크기가 회복되는 경향을 보였다. 이는 체중 변화와 유사한 경향을 나타낸다. 또한, 간과 신장은 대사와 해독 기능을 담당하는 생리적 장기로, 무게 변화가 있을 경우 조직 손상이나 독성 반응을 반영하므로 독성 평가의 기준으로 사용된다. 간과 신장의 무게에서는 CSPE-Ⅰ 투여로 인한 유의미한 결과가 관찰되지 않았다. 따라서, 15일간의 CSPE-Ⅰ 투여는 체내 독성을 나타내지 않는 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 CSPE-Ⅰ이 CTX로 유도된 면역 기관 위축을 완화함과 동시에 면역 회복 효과를 나타낼 가능성을 시사하였다. 따라서 이를 보다 구체적으로 확인하기 위해, mouse에서 회수한 대식세포의 활성 변화와 cytokine 분비를 분석하였다. 그 결과, NC 군에서는 증식 능력이 감소하였으나, CSPE-Ⅰ 투여군에서는 회복 경향을 보였으며, 탐식능과 NO, IL-6의 분비 역시 유사한 결과를 나타냈다. 자연살해세포는 항원으로 감염된 정상세포와 체내에서 발생한 암세포를 선택적으로 인식하여 제거하는 세포이다. CSPE-Ⅰ을 투여한 mouse에서 얻어진 NK 세포의 활성 정도를 평가하기 위해 종양세포 YAC-1에 대한 사멸 정도를 측정한 결과, CH 군에서 가장 높은 활성이 나타났으며, 이는 NT 군 수준으로 회복된 수치였다. 한편, T림프구의 표현형을 유세포 분석으로 확인한 결과, CD4+/CD8a+의 비율은 NT 군에서 3.62, NC 군에서 1.81로 감소하였으나, CH 군에서는 2.72로 유의미한 회복을 보였다. 따라서 CSPE-Ⅰ은 후천 면역세포를 포함한 다양한 면역세포를 동시에 활성화할 수 있는 것으로 판단되었다. 혈청 및 비장에 분비된 면역 관련 단백질 농도로 ELISA로 측정한 결과, 혈청 내 IL-6와 IL-12의 분비는 NC 군에서는 급격히 감소하였으나, CH 투여군에서는 강력한 완화 효과가 나타났으며, IgA와 IgG 또한 동일한 경향을 보였고, 대부분 바이오마커에 대해서도 비장에서 일관된 양상이 관찰되었다. 또한 회수한 비장 세포에서 MAPK 및 NF-κB 경로의 경우에서도, 두 경로를 모두 활성화하였다. 다당류가 장내 미생물에 의해 소화되어 발생하는 단쇄지방산은 장 염증 억제와 면역세포 조절에 기여하고 있다. 분석 결과, 모든 단쇄지방산의 수치는 NC 군에서는 농도가 감소한 반면, CSPE-Ⅰ 투여군에서는 유의미하게 증가하였다.
우수한 면역증진 효과를 나타내는 커피실버스킨 유래 정제 다당의 구조 특성을 확인하기 위해 추가적 실험이 진행되었다. 커피실버스킨 유래 정제 다당 CSPE-Ⅰ은 β-Glucosyl Yariv reagent와 반응하여 적색환이 관찰되었다. 또한, Congo red와의 반응성을 통해 CSPE-Ⅰ이 random coil 형태로 존재함이 확인되었으며, FT-IR 분석을 통해서 전형적인 다당류의 작용기를 소유함을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, 커피실버스킨 유래 다당의 면역 증진 활성은 다양한 가지 구조를 지닌 특이한 RG-Ⅰ 구조에 기인함을 알 수 있었다. 특히 이러한 구조적 특성은 단순 다당과 달리 면역세포의 인식과 활성화를 보다 효과적으로 촉진할 수 있는 능력을 제공하며, 여러 종류의 면역세포를 동시에 자극함으로써 면역 활성화 관련 cytokine 및 각종 면역조절 단백질의 분비를 유도하며, 이러한 과정은 선천면역과 후천면역 경로 모두에 영향을 미치며, 최종적으로 체내 면역 반응을 강화하고 면역체계의 균형을 유지하는 데 중요한 역할을 수행하는 것으로 판단되었다.
커피실버스킨 유래 정제 다당은 향후 건강기능식품 소재 개발을 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 커피 부산물을 활용한 기능성 소재 연구 및 산업적 응용 가능성을 확대하는 데에도 중요한 근거를 제공할 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Coffee silver skin, a major by-product of the roasting process, contains various bioactive compounds. This study was designed to evaluate the immunomodulatory effects of polysaccharides isolated from coffee silver skin and to characterize the structural features responsible for their biological activity.
Crude polysaccharides (CSP) as obtained by hot-water extraction of from coffee silver skin and subsequent ethanol precipitation. To enrich the active components, CSP was further treated with pectinase to selectively remove the inactive homogalacturonan (HG) regions, yielding the enzyme-treated fraction, CSPE. Chemical composition analysis revealed that CSPE consisted primarily of neutral sugar, uronic acid, and minor amounts of polyphenols, with monosaccharide composition of rhamnose (19.8%), arabinose (7.9%), galactose (20.8%), and galacturonic acid (38.9%). To identify the active moiety of CSPE, CSPE was further purified by size exclusion chromatography using Sephadex G-75, yielding CSPE-Ⅰ, CSPE-Ⅱ, CSPE-Ⅲ, and CSPE-Ⅳ. Among them, CSPE-Ⅰ exhibited a monosaccharide composition of rhamnose (11.7%), arabinose (14.1%), galactose (34.1%), and galacturonic acid (15.6%), exhibiting a structural characteristic of rhamnogalacturonan-I (RG-I). In peritoneal macrophages, CSPE-Ⅰ induced the highest cytokine secretion. Also in vitro study using RAW 264.7 cells, CSPE-I significantly enhanced phagocytic activity and stimulated the production of nitric oxide (NO) and cytokines (IL-6 and TNF-α), and upregulated IL-6, iNOS, and TNF-α gene expression. Western blot analysis revealed that CSPE-Ⅰ activated MAPK signaling pathways, particularly ERK and p38 phosphorylation, and promoted IκBα degradation in the NF-κB pathway.
The in vivo immunomodulatory effects of CSPE-Ⅰwere evaluated in a cyclophosphamide (CTX)-induced immunosuppressed mouse model. Prophylactic oral administration of CSPE-I significantly alleviated CTX-induced body weight loss and lymphoid tissue (thymus and spleen) damage without systemic toxicity. Furthermore, CSPE-I treatment recovered NK cell cytotoxicity, macrophage functions, and the CD4+/CD8+ T cell ratio. Elevated levels of serum/splenic cytokines (IL-6, IL-12), which correlated with MAPK and NF-κB activation, and immunoglobulins (IgA, IgG) confirmed the enhancement of both innate and adaptive immune responses. Furthermore, CSPE-I repaired CTX-induced impairments in short-chain fatty acids (SCFAs) production. These findings demonstrate that the RG-I type polysaccharide CSPE-I from coffee silver skin is a potent immunomodulator that enhances both innate and adaptive immune responses.
This study provides a scientific foundation for utilizing coffee by-products as high-value functional biomaterials in the development of immune-boosting functional food ingredients.

목차 (Table of Contents)

• 제 1 장 서론 1
• 제 2 장 실험 재료 4
• 제 1 절 실험 재료 4
• 제 2 절 실험 시약 4
• 제 3 절 실험 동물 5
• 제 3 장 실험 방법 6
• 제 1 절 커피실버스킨 유래 다당의 분리 6
• 제 1 항 커피실버스킨 유래 다당의 분리 6
• 제 2 항 커피실버스킨 유래 다당의 효소 처리 6
• 제 3 항 커피실버스킨 유래 다당의 정제 7
• 제 4 항 일반 분석 10
• 제 5 항 구성당 분석 10
• 제 6 항 분자량 분포도 분석 12
• 제 2 절 커피실버스킨 유래 다당의 면역 활성 14
• 제 1 항 대식세포의 cytokine 분비능 14
• 제 3 절 커피실버스킨 유래 정제 다당 CSPE-Ⅰ의 대식세포 활성화 및 세포 내 신호전달 메커니즘 규명 15
• 제 1 항 Mouse 유래 대식세포주 RAW 264.7 cell의 cytokine 및 chemokine 분비능 15
• 제 2 항 Mouse 유래 대식세포주 RAW 264.7 cell의 탐식능 16
• 제 3 항 qPCR을 통한 mRNA 발현도 측정 16
• 제 4 항 Western blotting을 통한 MAPK 및 NF-κB 경로 활성화 확인 19
• 제 4 절 면역 억제 mouse 모델에서 커피실버스킨 유래 정제 다당 CSPE-Ⅰ의 경구투여에 따른 면역증진 효과 평가 21
• 제 1 항 면역 억제 mouse 모델 21
• 제 2 항 경구 투여에 따른 대식세포 활성화 23
• 제 3 항 경구 투여에 따른 자연살해세포 활성화 23
• 제 4 항 경구 투여에 따른 세포 독성 T 림프구의 아형 변화 24
• 제 5 항 경구 투여에 따른 세포 내 신호 전달 경로 활성화 24
• 제 6 항 경구 투여에 따른 체내 immunoglobulin 및 cytokine 분비 평가 25
• 제 7 항 경구 투여에 따른 분변 내의 단쇄지방산 함량 측정 25
• 제 5 절 커피실버스킨 유래 정제 다당 CSPE-Ⅰ의 구조적 특성 규명 28
• 제 1 항 β-Glucosyl Yariv reagent 반응을 활용한 type Ⅱ arabino-3,6–galactan의 정성 및 정량 분석 28
• 제 2 항 Congo red와의 반응성 28
• 제 3 항 FT-IR을 통한 functional group 확인 29
• 제 6 절 통계처리 30
• 제 4 장 결과 및 고찰 31
• 제 1 절 커피실버스킨 유래 다당의 분리·정제 및 화학적 특성 31
• 제 1 항 커피실버스킨 유래 다당의 분리 31
• 제 2 항 커피실버스킨 유래 조다당 CSP의 일반 화학적 특성 31
• 제 3 항 커피실버스킨 유래 다당의 효소 처리 32
• 제 4 항 커피실버스킨 유래 효소 처리 조다당 CSPE의 일반 화학적 특성 33
• 제 5 항 커피실버스킨 유래 다당의 정제 33
• 제 6 항 커피실버스킨 유래 정제 다당의 일반 화학적 특성 34
• 제 2 절 커피실버스킨 유래 다당의 면역 활성 39
• 제 1 항 커피실버스킨 유래 조다당 CSP와 효소 처리 조다당 CSPE의 대식세포의 cytokine 분비능 39
• 제 2 항 커피실버스킨 유래 정제 다당의 대식세포의 cytokine 분비능 40
• 제 3 절 커피실버스킨 유래 정제 다당 CSPE-Ⅰ의 대식세포 활성화 및 세포 내 신호전달 메커니즘 규명 44
• 제 1 항 Mouse 유래 대식세포주 RAW 264.7 cell의 cytokine 및 chemokine 분비능 44
• 제 2 항 Mouse 유래 대식세포주 RAW 264.7 cell의 탐식능 45
• 제 3 항 qPCR을 통한 mRNA 발현도 측정 45
• 제 4 항 Western blotting을 통한 MAPK, NF-κB 경로 활성화 확인 46
• 제 4 절 면역 억제 mouse 모델에서 커피실버스킨 유래 정제 다당 CSPE-Ⅰ의 경구투여에 따른 면역증진 효과 평가 53
• 제 1 항 경구 투여에 따른 면역 억제 mouse 모델의 임상 증상 변화 53
• 제 2 항 경구 투여에 따른 대식세포 활성화 55
• 제 3 항 경구 투여에 따른 자연살해세포의 활성화 56
• 제 4 항 경구 투여에 따른 T 림프구의 아형 변화 57
• 제 5 항 경구 투여에 따른 세포 내 신호 전달 경로 활성화 58
• 제 6 항 경구 투여에 따른 체내 immunoglobulin 및 cytokine 분비 평가 58
• 제 7 항 경구 투여에 따른 분변 내의 단쇄지방산 함량 측정 60
• 제 5 절 커피실버스킨 유래 정제 다당 CSPE-Ⅰ의 구조적 특성 규명 72
• 제 1 항 β-Glucosyl Yariv reagent 반응을 활용한 type Ⅱ arabino-3,6–galactan의 정성 및 정량 분석 72
• 제 2 항 Congo red와의 반응성 73
• 제 3 항 FT-IR을 통한 functional group 확인 74
• 참고문헌 78
• Abstract 85