비소세포폐암에서 YES1-YAP 신호전달의 활성화가 항암제 저항성 획득에 미치는 연구 기전

국문 초록 (Abstract)

폐암은 전 세계적으로 가장 높은 사망률을 보이는 질환 중 하나로, 사망자 수도 가장 많은 암종이다. 특히 국내에서도 폐암은 암 발병률은 2위이나, 사망자 수는 1위인 무서운 암종이다. 이러한 폐암은 암세포의 크기 및 형태에 따라 세포의 크기가 작은 소세포폐암(small cell lung cancer, SCLC)와 세포의 크기가 작지 않은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)로 나누어진다. 특히 NSCLC는 전체 폐암 환자 중 80~85%을 차지하며, 이를 치료하기 위한 여러 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만, 항암제에 대한 약물 내성 문제는 환자의 생존율 향상의 큰 장애물이다. 따라서 항암제 투여 시 발생하는 표피 성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor, EGFR) 돌연변이를 타겟으로 하는 표적 항암제의 내성 작용 기전의 연구와 혁신적인 저해제 탐색이 필요하다.
타이로신 카이네이즈 저해제(Tyrosine kinase inhibitor, TKI)는 EGFR을 표적으로 하는 분자로, TKI 중 하나인 osimertinib은 EGFR 돌연변이를 갖는 NSCLC 환자에서 표준 1차 표적 치료제로 활용되고 있다. 하지만 NSCLC에서 EGFR-TKI 내성을 보유하는 환자들이 증가하면서, 치료 성과는 여전히 제한적이다. 따라서, 본 연구에서는 EGFR 돌연변이 NSCLC에서 TKI의 저항성과 관련된 단백질인 YES-associated protein (YAP)의 발현과 기능을 규명한다. YAP은 세포 주기, 이동성, 사멸 등의 세포 기능을 조절하며, 이러한 조절을 통해 조직의 크기 및 세포 분열을 조절한다. 특히 TEA domain(TEAD) 전사인자와 상호작용하여 표적 유전자의 발현을 유도함으로써 종양 촉진 활성을 증가시키며, 암의 진행 및 치료 저항성과 밀접하게 관련되어 있다.
위 내용을 증명하고자 EGFR 돌연변이를 보유한 H1975 세포를 이용해 암세포가 보유한 TKI의 저항성과 관련된 기능을 연구하였다. H1975 모세포(H1975-P)에 비해 osimertinib에 저항성을 보유한 H1975 세포(H1975-OR)에서 EGFR과 YES1의 mRNA 및 단백질 발현 수준이 증가되어있으며, colony 형성 능력 또한 증가됨을 알 수 있다. 더불어 YAP과 YAP의 Tyr357 잔기 인산화가 H1975-P에 비해 H1975-OR 세포에서 함께 증가되어있는 것을 알 수 있었으며, 이는 핵 내 TEAD 발현 및 인산화된 YAP의 축적과 동반되었다. 또한 YAP의 인산화와 안정화에 관여한다고 알려져 있는 YES1의 발현 억제는 YAP의 인산화와 핵 내 이동, Bcl-2, Cyclin D1, CD133의 발현, 그리고 TEAD 이동을 감소시켰다. 동시에 H1975-OR 세포의 증식, 이동, colony 형성 능력이 억제되었다. TEAD와 YAP의 상호작용을 allosteric하게 억제하는 저분자 화합물인 TED-347의 처리는 TEAD 및 항산화 단백질인 Nrf2와 그 하위 단백질인 NQO1과 HO-1의 발현을 억제하였으며, colony 형성 능력 또한 저해 시켰다. 또한, YAP 저해제인 verteporfin의 처리를 통해 YAP을 저해 시키는 것을 확인할 수 있었으며, YAP 뿐만 아니라 YAP과 상호 작용하는 TEAD, 항산화 단백질인 Nrf2와 그 하위 인자까지 감소 시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 YES1의 특이적 저해제인 dasatinib은 H1975-OR 세포의 생존율을 감소시켰으며, osimertinib과 병용 시 상승적 억제 효과를 나타냈다.
따라서 위 결과들을 통해 EGFR 돌연변이 세포에서 약물 내성에 의해 발생하는 YES1 과발현은 세포의 이동과 증식을 촉진시키며, 이러한 YES1의 발현 억제는 약물 내성에 깊은 연관이 있는 YAP의 발현 및 핵 내 이동을 억제한다. 이러한 결과는 YES1에 의해 조절되는 YAP의 활성화가 NSCLC에서 TKI에 내성을 극복하기 위한 치료 표적이 될 수 있음을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Lung cancer is one of the leading causes of cancer-related mortality worldwide and remains the most fatal malignancy, accounting for the highest number of cancer deaths. In Korea as well, lung cancer ranks second in cancer incidence but first in cancer-related mortality, illustrating its aggressive nature. Lung cancers are classified into small-cell lung cancer(SCLC) and non-small-cell lung cancer(NSCLC) according to cellular size and morphology. Among these, NSCLC accounts for approximately 80-85% of all lung cancer cases, and extensive research has focused on improving therapeutic outcomes. However, drug resistance to anticancer therapies remains a major obstacle to improving patient survival. Therefore, elucidating the resistance mechanisms to targeted therapies against epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations and exploring innovative inhibitory strategies are urgently needed.
Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) are molecular agents that target EGFR, and Osimertinib-one of these TKIs-has become the standard first-line targeted therapy for NSCLC harboring EGFR mutations. Nevertheless, the increasing number of NSCLC patients acquiring resistance to EGFR-TKIs continues to limit therapeutic efficacy. Thus, this study aims to investigate the expression and functional role of the YES-associated protein (YAP), a protein associated with TKI resistance in EGFR-mutant NSCLC.
YAP is a transcriptional co-activator regulating essential cellular processes such as the cell cycle, migration, and apoptosis, thereby contributing to tissue growth and cellular proliferation. Through its interaction with TEA domain (TEAD) transcription factors, YAP promotes the expression of oncogenic target genes and is strongly implicated in tumor progression and therapeutic resistance.
To validate these mechanisms, we examined TKI resistance-associated functions using the EGFR-mutant NSCLC cell line H1975. Compared to parental H1975 cells (H1975-P), Osimertinib-resistant H1975 cells (H1975-OR) exhibited elevated mRNA and protein expression levels of EGFR and YES1, along with enhanced colony-forming ability. Additionally, both YAP expression and phosphorylation at tyrosine 357 were increased in H1975-OR cells relative to H1975-P cells, accompanied by elevated nuclear TEAD levels and nuclear accumulation of phosphorylated YAP. Furthermore, inhibition of YES1-a known regulator of YAP phosphorylation and stabilization-reduced YAP phosphorylation, nuclear translocation, and the expression of Bcl-2, Cyclin D1, CD133, and TEAD. Consequently, proliferation, migration, and colony formation were markedly suppressed in H1975-OR cells.
Treatment with TED-347, a small-molecule allosteric inhibitor that disrupts TEAD-YAP interactions, reduced the expression of TEAD, the antioxidant regulator Nrf2, and its downstream effectors NQO1 and HO-1, while also suppressing colony formation. Likewise, the YAP inhibitor Verteporfin significantly decreased YAP levels as well as TEAD, Nrf2, and its downstream antioxidant proteins. The YES1-specific inhibitor Dasatinib reduced cell viability in H1975-OR cells and exhibited synergistic inhibitory effects when administered in combination with Osimertinib.
Collectively, these findings demonstrate that YES1 overexpression induced by drug resistance in EGFR-mutant NSCLC enhances cellular migration and proliferation, while suppression of YES1 inhibits YAP activation and nuclear translocation-key contributors to TKI resistance. These results suggest that targeting the YES1-mediated activation of YAP represents a promising therapeutic strategy to overcome TKI resistance in NSCLC.

목차 (Table of Contents)

• 1. 서론 1
• 1.1 연구 배경 1
• 1.2 Hippo pathway의 개요 4
• 1.3 종양에서 YAP의 역할 7
• 2. 재료 및 실험 방법 11
• 2.1 세포 배양 조건 및 세포 수집 11
• 2.2 세포 약물 처리 조건과 YES1, Nrf2 transfection 12
• 2.3 단백질 추출 14
• 2.4 세포질 및 핵 단백질 추출 15
• 2.5 Western blot analysis 17
• 2.6 Cell viability assay 18
• 2.7 RNA 분리 및 RT-qPCR 19
• 2.8 Wound migration assay 22
• 2.9 Colony formation assay 23
• 2.10 Analysis of intracellular ROS accumulation 24
• 2.11 Immunoprecipitation 25
• 2.12 immunocytochemistry 26
• 2.13 시약 및 기구 27
• 3. 결과 29
• 3.1 H1975-P, H1975-OR 세포 사이의 Osimertinib 저항성과 YES1/YAP의 발현 비교 29
• 3.2 H1975-OR 세포에서 YES1 억제가 세포 생존, 이동성 및 군집 형성 능력에 미치는 영향 32
• 3.3 H1975-OR 세포에서 YES1 억제가 YAP 발현과 핵 내 전사 조절에 미치는 영향 34
• 3.4 YES1 억제가 H1975-OR 세포의 Nrf2와 매개 항산화 유전자 발현 및 ROS 축적에 미치는 영향 38
• 3.5 H1975-OR 세포에서 YAP 표적 저해제 처리에 따른 효능 평가 42
• 3.6 TEAD 표적 저해제가 H1975-OR 세포의 항산화 관련 단백질 발현과 군집 형성에 미치는 영향 44
• 3.7 Nrf2 억제가 항산화 유전자 발현 미 YES1-YAP 신호 조절에 미치는 영향 46
• 3.8 H1975-OR 세포에서 Nrf2 억제가 세포 이동성 및 colony-forming capacity에 미치는 영향 48
• 3.9 H1975-OR 세포에서 osimertinib 단독 및 dasatinib 병용 처리에 따른 세포의 민감도 변화 분석 50
• 4. 고찰 52
• 참고문헌 56
• Abstract 63