HCT116 세포에서 Lysophosphatidic acid Receptor 2와 Sphingosine-1-phosphate Receptor 4, 5의 상호작용이 종양 촉진에 미치는 영향

국문 초록 (Abstract)

대장암은 전 세계 암 발생의 약 9.6%로, 발생률 3위에 해당하며 암으로 인한 사망의 약 9.3%를 차지해 사망률 2위에 해당하는 주요 암종이다. 대장암은 생활습관, 염증, 유전적 요인 등이 복합적으로 관여하여 발병한다. 최근에는 GPCR을 포함한 하위 신호전달 경로에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으며 새로운 치료 표적을 발견하는 데 있어서 그 중요성이 더욱 강조되고 있다.
G-protein coupled receptor (GPCR)은 세포막에 위치한 수용체로, 7 transmembrane domains (7TM) 구조를 가지는 것이 특징이다. GPCR은 G-protein과 결합하여 세포 외부의 자극을 세포 내부의 신호로 전달하는 데 핵심적인 역할을 하며, 세포 증식, 이동 및 생존을 포함한 다양한 생리적 과정을 조절하고, 암을 포함한 여러 질병의 발생 및 진행과도 밀접하게 연관되어 있다. 현재 승인된 약물의 약 30% 정도가 GPCR을 표적으로 하고 있기 때문에 약물 개발 측면에서도 그 중요성이 매우 크다.
LPA 수용체는 bioactive phospholipid인 LPA를 리간드로 하는 GPCR의 한 종류이며, LPA1에서 LPA6까지 총 6개의 subtype이 존재하는 것으로 알려져 있다. 본 논문에서는 LPA2에 초점을 맞추고 있으며, LPA2는 Gαi/o, Gαq/11, Gα12/13과 coupling이 되어 있다. 특히 HCT116세포에서 높은 수준으로 과발현하며, LPA 신호전달은 세포 이동성과 함께 항암제 저항성을 증가시키기 때문에 대장암 연구에서 중요한 타겟이 된다.
S1P 수용체는 S1P를 리간드로 하는 GPCR로, S1P1부터 S1P5까지 총 5개의 subtype이 있다. 본 논문에서는 S1P5에 초점을 맞추었으며, S1P5는 Gαi/o, Gα12/13과 결합하여 세포 생존, 세포사멸, 세포골격 재편성 등을 조절한다. S1P 수용체는 암과 면역계 모두에서 중요한 역할을 한다는 점에서 연구적 가치가 크다.
최근 연구를 통해 GPCR은 단일 수용체로 기능하는 것 외에도 동종 (homo) 또는 이종 (hetero) 수용체와 이량체 (dimer)를 형성한다는 것이 보고되었다. GPCR이 서로 결합하면 단독으로는 나타나지 않는 신호를 만들 수 있으며, 리간드 결합 친화도, 하위 신호전달 등 여러 기능적 특성이 변하는 것으로 알려져 있다.
본 연구에서는 살아있는 세포에서 Bioluminescence Resonance Energy Trnasfer (BRET) assay를 통해 LPA2와 S1P5가 강한 상호작용을 보임을 확인하였다. 연구 중 LPA2와 S1P4 또한 강하게 상호작용한다는 사실을 발견하여 추가적으로 Lyn-YFP를 이용하여 S1P4와의 결합 특이성을 확인하였다. 이후 공초점 레이저 주사 현미경 (Confocal microscopy)으로 LPA2와 S1P5의 세포 내 위치를 확인하였고, 이를 통해 작용제를 단독으로 처리하였을 때도 두 수용체가 함께 내제화됨을 확인하였다. LPA2와 S1P5가 내생적으로 발현하는 대장암 세포주인 HCT116 세포를 이용하여 두 수용체가 상호작용할 때 암세포에 어떤 영향을 미치는지 분석하였다. 본 연구에서는 보여주고 있지 않지만, 추가로 Wound-Healing assay와 Transwell assay를 통해 LPA2와 S1P4 또는 S1P5의 작용제를 각각 처리하면 암세포의 증식 및 전이가 증가하며, 함께 처리하면 감소함을 확인하였다. 또한 Western blot을 통해 암세포가 증식하는 데 중요한 역할을 한다고 알려진 ERK의 인산화 수준을 확인하였다. LPA2와 S1P4 또는 S1P5를 함께 발현시켰을 때 ERK와 AKT의 인산화 수준이 감소하는 경향을 보이지 않아 해당 신호전달은 ERK 및 AKT pathway를 경유하지 않는 것을 알 수 있었다. RT-qPCR을 통해 암 진행과 관련된 유전자의 발현 수준을 확인하였다. LPA2와 S1P4 또는 S1P5를 동시에 발현시켰을 때 Hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1α), Basic transcription factor 3 (BTF3), Antigen Kiel 67 (Ki-67)의 발현 수준이 감소함을 확인하였다.
본 연구는 LPA2와 S1P5가 homodimer를 이루어 서로 물리적, 기능적으로 상호작용함을 밝힌 최초의 논문이라는 점에서 의의가 있다. 또한 LPA2와 S1P4 dimer 또는 LPA2와 S1P5 dimer를 표적으로 하는 치료제를 개발하는 데 있어 연구의 기반을 마련해줄 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Lysophosphatidic acid (LPA) and sphingosine-1-phosphate (S1P) are known to regulate cell proliferation and migration in various cancers. LPA and S1P act as ligands by binding to their cognate G-protein coupled receptors (GPCRs). Although LPA2 and S1P5 are highly expressed in several types of cancer, including colorectal cancer, their potential interaction has not been well characterized. In this study, we demonstrated the physical interaction between LPA2 and S1P5 using a bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay, which revealed strong association and high affinity between the two receptors. Confocal microscopy further showed that both receptors localize at the plasma membrane under basal conditions; however, activation of either receptor alone was sufficient to induce co-internalization of both receptors into intracellular compartments. To investigate downstream signaling associated with this interaction, we utilized HCT116 cells, which endogenously express both receptors. Co-activation of LPA2 and S1P4 or S1P5 did not engage the ERK or AKT pathways. Moreover, simultaneous activation of both receptors led to decreased expression of transcription factors associated with cancer progression. Taken together, these findings provide novel insight into the functional interplay between LPA2 and S1P4 or S1P5 and suggest that their heteromerization may modulate non-canonical signaling pathways in colorectal cancer cells.

목차 (Table of Contents)

• 제 1 장 서론 1
• 제 1 절 G-protein coupled receptor (GPCR) 1
• 제 2 절 Lysophosphatidic acid receptor 2 (LPA2) 4
• 제 3 절 Sphingosine-1-phosphate receptor 4, 5 (S1P4, 5) 6
• 제 4 절 GPCR dimerization 8
• 제 5 절 연구목적 10
• 제 2 장 실험재료 및 방법 11
• 제 1 절 실험재료 11
• 1. 실험 균주 11
• 2. 재조합 플라스미드 12
• 3. 동물 세포주 13
• 4. 균주배양 배지 조성 및 제조 14
• 1) 액체 배지 제조 14
• 2) 고체 배지 제조 15
• 3) Carbenicillin 제조 15
• 4) Kanamycin 제조 16
• 5. 항체 17
• 6. LPA2, S1P4, S1P5 작용물질 18
• 제 2 절 실험방법 19
• 1. 플라스미드 순수분리 19
• 2. 동물세포 배양 20
• 1) 293T 세포 배양 20
• 2) HCT116 세포 배양 20
• 3. Transfection - Polyethyleneimine (PEI) 방법 21
• 4. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay22
• 5. Confocal microscopy imaging 24
• 6. Bradford assay 25
• 7. Western blot analysis 26
• 8. Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) 31
• 9. Statistical analysis 33
• 제 3 장 결 과 34
• 제 1 절 LPA2와 S1P5의 결합특성 확인 34
• 1. LPA2와 S1P 수용체 family의 결합특성 확인 34
• 2. LPA2 또는 LPA3와 S1P5 간의 결합특이성 확인 35
• 3. LPA2 또는 LPA2-△C와 S1P5 간의 결합특이성 확인 36
• 4. GRI-977143과 A971432 처리 여부에 따른 LPA2와 S1P5의
• 결합특성 변화 확인 38
• 5. LPA2 또는 Lyn-YFP와 S1P4 또는 S1P5 간의 결합특이성
• 확인 40
• 제 2 절 LPA2와 S1P5의 세포 내 위치 확인 42
• 1. GRI-977143과 A971432 자극에 따른 LPA2와 S1P5의 세포 내
• 위치 확인 42
• 2. GRI-977143과 A971432 자극에 따른 LPA2와 S1P5의 세포
• 내재화 비율 확인 45
• 제 3 절 LPA2와 S1P5가 내생적으로 발현하는 세포에서 신호전달 변화 확인 46
• 1. LPA2와 S1P5의 상호작용에 따른 ERK 인산화 변화 확인 46
• 2. LPA2와 S1P5의 상호작용에 따른 AKT 인산화 변화 확인 48
• 제 4 절 LPA2와 S1P4 또는 S1P5에 의한 암 진행 관련 전사인자 발현 변화 확인 50
• 제 4 장 고 찰 52
• 제 5 장 결 론 54
• 참고문헌 55
• Abstract 58