Gene-based Dysbiosis Index for Characterizing Gut Microbiome in Canine Fecal Microbiota Transplantation Recipients : 개의 분변 미생물 이식 수혜자에서 장내 미생물군 특성 규명을 위한 유전자 기반의 미생물 불균형 지표

국문 초록 (Abstract)

개의 만성 장병증(CE)은 장내 미생물 불균형(dysbiosis)을 동반하지만, 기존의 분류군(taxa) 기반 지수는 기능적 변화를 포착하기에는 해상도가 부족하다는 한계가 있다. 본 연구는 분변 미생물 이식(FMT)의 효과와 dysbiosis가 만들어내는 차이를 장내미생물 군집 수준에서 기능 유전자 수준까지 'top-down' 방식으로 관찰하고자 하였다. 나아가, 이러한 분석 결과를 바탕으로 견고한 유전자 기반의 dysbiosis index를 개발하고 검증하는 것을 목표로 하였다. 연구의 첫 단계로, 메타지노믹스 기법을 사용해 FMT 후 CE견의 마이크로바이옴 복원 과정을 분석하였다. FMT 결과, 군집 구조가 성공적으로 복원되었으며, 항생제 저항성 유전자(ARGs), 독성 인자(VFs), 이동성 유전 인자(MGEs)의 총량 또한 감소하였다. 이를 통해 dysbiosis가 유전자 수준에서도 발생하는 현상임을 확인하였다. 다음, 40개의 샷건 메타지놈(CE 20개, Healthy 20개) 데이터로 구성된 훈련 코호트를 LASSO, RF, SVM 3개의 포괄적인 머신러닝 파이프라인에 적용해 dysbiosis index를 개발하였다. 그 결과, 훈련 세트에서 높은 진단 정확도(AUC = 0.90)를 보이는 견고한 2개의 index 유전자를 발굴하였다. 이 지수는 40개 데이터로 구성된 독립적인 검증 세트에서도 뛰어난 성능(AUC = 0.94)을 보였다. 주목할 점은, 이 두 마커 유전자가 Blautia와 Intestinibacter에서 유래한 '기능 미상 단백질(hypothetical protein)'로 확인되었다는 것이며, 이는 개의 dysbiosis를 설명하는 새로운 생물학적 표지자일 수 있음을 시사한다. 결론적으로, 본 연구는 기존 taxa 기반 지수보다 우수한, 장내 미생물 불균형을 정량적으로 측정할 수 있는 유전자 기반 도구를 성공적으로 개발하고 검증하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Canine chronic enteropathy (CE) is characterized by intestinal dysbiosis, yet taxa-based indices often lack the resolution needed to capture underlying functional alterations. This study set out to examine dysbiosis-driven differences and the therapeutic impact of fecal microbiota transplantation (FMT) using a top-down metagenomic framework, ranging from community-level changes to gene-level functional shifts, with the broader aim of developing a gene-based dysbiosis index. Shotgun metagenomic profiling demonstrated that FMT effectively restored microbial community structure in CE dogs and reduced the overall abundance of antibiotic resistance genes (ARGs), virulence factors (VFs), and mobile genetic elements (MGEs), confirming that dysbiosis manifests at both the taxonomic and functional gene levels. A cohort of 40 shotgun metagenomes (20 CE and 20 healthy) was then analyzed using three machine learning pipelines (LASSO, Random Forest, and SVM) to construct the dysbiosis index. This analysis identified two highly robust marker genes that achieved strong diagnostic accuracy in the training set (AUC = 0.90) and maintained excellent performance in an independent validation cohort of 40 samples (AUC = 0.94). Both markers were annotated as hypothetical proteins originating from Blautia and Intestinibacter, suggesting that they may represent previously unrecognized functional signatures of canine dysbiosis. In summary, this study establishes and validates a high resolution, gene-based tool for quantitatively assessing intestinal dysbiosis in CE, offering improved performance over conventional taxa-based indices.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 1.1. Canine gut microbiome 1
• 1.2. Chronic enteropathy (CE) in dogs 2
• 1.3. Dysbiosis and its link to CE 3
• 1.4. Need for functional and multi-dimensional microbiome assessment in CE 4
• 1.5. Fecal microbiota transplantation (FMT): concept and veterinary applications 5
• 1.6. Shotgun metagenomics and functional gene-based approaches 6
• 1.7. Rationale for the study 7
• 2. Materials and Methods 9
• 2.1. Enrollment of study animals and fecal sample collection 9
• 2.2. DNA extraction and metagenomic sequencing 10
• 2.3. Collection of shotgun metagenomic data for dysbiosis index construction 11
• 2.4. Bioinformatic analysis of 16S rRNA gene sequencing data 15
• 2.5. Effects of FMT and dysbiosis on gut microbiome diversity 16
• 2.6. Strain-level characterization of gut microbiome via Metagenome-Assembled Genomes (MAGs) 18
• 2.7. Analysis of resistome, mobileome and virulome 19
• 2.8. Network analysis of mobileome, resistome, and virulome 20
• 2.9. Pipeline for dysbiosis index development 23
• 2.10. Validation of final dysbiosis index 26
• 3. Results 27
• 3.1. FMT ameliorates community-level dysbiosis in CE dogs 27
• 3.2. Strain-level alterations in the gut microbiome revealed by MAGs 29
• 3.3. Temporal dynamics of mobileome, resistome, and virulome 31
• 3.4. Correlation networks of mobileome with resistome and virulome 34
• 3.5. Machine learning (ML) based index candidate selection 37
• 3.6. Derivation of the final dysbiosis index equation via LASSO 41
• 3.7. Independent validation confirms the robustness of the dysbiosis index 44
• 3.8. Functional Characterization of the Identified Dysbiosis Index Marker Genes 46
• 4. Discussion 50
• 5. Reference 54
• (Abstract) 60
• (초록) 62