Detrimental Effects of Ethylene Oxide on Sperm Function : 에틸렌 옥사이드가 정자 기능에 미치는 유해한 영향

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Ethylene oxide (E.O) is the ether compound used to create ethylene compounds and a sterilizer in industries. E.O has been reported to have detrimental effects in mammals, including reproductive toxicity. Previous studies on male reproductive toxicity have reported its harmful effects; however, the impact of E.O toxic effects on sperm capacitation remains poorly understood. Therefore, the present investigation was performed to evaluate the impact of E.O exposure on sperm functions with different concentrations of E.O (0, 0.1, 1, 10, and 100 μМ). In this study, sperm motion parameters, cell viability, intracellular ATP levels, capacitation status, expression levels of phospho-protein kinase A (PKA) substrates, and tyrosine phosphorylated proteins were measured. The results showed that the E.O treatment group significantly decreased sperm motion parameters and the intracellular ATP levels. In addition, E.O exposure led to an abnormally increased number of capacitated spermatozoa. Western blot results showed abnormally changed phospho-PKA substrates and decreased tyrosine phosphorylated proteins after E.O treatment. Consequently, these findings suggest that E.O might negatively impact sperm function, resulting in male reproductive toxicity. Nevertheless, the molecular mechanisms fundamental to the E.O-induced inhibition of sperm function are not fully understood. Ras-associated binding (Rab) proteins play key roles in sperm function, such as sperm capacitation and acrosome reaction. Accordingly, the investigation focused on elucidating the molecular mechanisms fundamental to the E.O-induced toxic effects on sperm motility by concentrating on the Rab proteins. Therefore, we analyzed thirty-one individual Duroc semen samples to determine the correlations between six Rab protein levels, including Rab3A, Rab5, Rab14, Rab25, Rab27A, and Rab34, and sperm motility after 100 μM E.O exposure. Results showed that the 100 μM E.O group had significantly decreased sperm motility and kinematic parameters. The correlation analysis revealed that Rab3A, Rab5, Rab14, Rab25, Rab27A, and Rab34 were correlated with various sperm motion parameters in the control group. By contrast, Rab3A and Rab14 showed correlation with multiple sperm motility and motion kinematic parameters in the 100 μM E.O group. These results might indicate that E.O affects sperm motion parameters through Rab proteins, leading to decreased sperm motion parameters. Hence, the current findings provide basic evidence for the molecular mechanisms underlying E.O-induced toxic effects on sperm function.

국문 초록 (Abstract)

에틸렌 옥사이드(E.O)는 산업에서 에틸렌 화합물과 살균제를 만드는 데 사용되는 에테르 화합물이다. E.O는 생식 독성을 포함하여 포유류에 해로운 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 특히 남성 생식 독성에 대한 이전의 연구에서는 해로운 영향이 보고되었지만, E.O 독성에 대한 영향이 정자 capacitation에 미치는 영향은 아직 충분히 밝혀지지 않았다. 따라서 본 연구는 다양한 농도의 E.O(0, 0.1, 1, 10 및 100 μM)를 사용하여 정자 기능에 대한 E.O 노출의 영향을 평가하기 위해 수행되었다. 본 연구에서는 정자 운동 매개변수, 세포 생존력, 세포 내 ATP 수준, capacitation 상태, PKA 인산화 기질의 발현 수준 및 티로신 인산화 단백질이 평가되었다. 결과적으로 E.O 처리 그룹이 정자 운동 매개변수와 세포 내 ATP 수준을 유의하게 감소시켰음을 보여주었다. 또한, E.O 노출은 capacitation이 일어난 정자의 수를 비정상적으로 증가시켰다. Western blot 분석 결과, E.O 처리 후 인산화 PKA 기질의 비정상적 변화와 티로신 인산화 단백질의 감소를 보여주었다. 이러한 결과는 E.O가 정자 기능에 부정적인 영향을 미쳐 남성 생식 독성을 유발할 수 있음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, E.O에 의한 정자 기능 억제의 근본적인 분자적 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. Ras associated binding (Rab) 단백질은 정자의 capacitation및 acrosome reaction에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구는 Rab 단백질에 집중하여 E.O에 의해 유발된 정자 운동성에 대한 독성 작용의 근본적인 분자적 기전을 규명하는 데 중점을 두었다. 따라서, 31마리의 듀록 정액 샘플을 분석하여 Rab3A, Rab5, Rab14, Rab25, Rab27A, Rab34를 포함한 6가지 Rab 단백질 수치와 100μM E.O 노출 후 정자 운동성 간의 상관관계를 분석했다. 그 결과, 100μM E.O 처리군은 정자 운동성과 운동학적 매개변수가 유의미하게 감소했다. 상관관계분석 결과, 대조군에서 Rab3A, Rab5, Rab14, Rab25, Rab27A, Rab34가 다양한 정자 운동 매개변수와 상관관계를 나타내었다. 반면, 100μM E.O 처리군에서는 Rab3A와 Rab14가 여러 정자 운동성 및 운동 역학 매개변수와 상관관계를 나타내었다. 이러한 결과는 E.O가 Rab 단백질을 통해 정자 운동 매개변수에 영향을 미쳐 정자 운동 매개변수를 감소시킨다는 것을 시사한다. 따라서 본 연구 결과는 E.O에 의해 유발된 독성 영향이 정자 기능에 작용하는 분자적 기전에 대한 기초적인 증거를 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• General Introduction 1
• CHAPTER Ⅰ TOXIC EFFECTS OF ETHYLENE OXIDE ON SPERMATOZOA DURING CAPACITATION 4
• A. INTRODUCTION 5
• B. MATERIALS AND METHODS 7
• 1. Chemicals and medium 7
• 2. Sample preparation and treatment of spermatozoa 7
• 3. Sperm motion parameters 8
• 4. Evaluation of sperm capacitation status 9
• 5. Measurement of sperm cell viability and intracellular ATP levels 10
• 6. Analysis of phospho-protein kinase A (PKA) activity and tyrosine phosphorylation 11
• 7. Statistical analysis 13
• C. RESULTS 14
• 1. Effects of E.O on sperm motion parameters 14
• 2. Effects of E.O on capacitation status 16
• 3. Impact of E.O on cell viability and intracellular ATP levels 18
• 4. E.O effects on PKA activity and tyrosine phosphorylation 20
• D. DISCUSSION 23
• Chapter Ⅱ ETHYLENE OXIDE CAUSES DETRIMENTAL EFFECTS ON SPERM MOTILITY BY ALTERING RAB PROTEIN EXPRESSIONS 26
• A. INTRODUCTION 27
• B. MATERIALS AND METHODS 29
• 1. Ethics statement 29
• 2. Chemicals and Reagents 29
• 3. Preparation of spermatozoa and treatment of E.O 29
• 4. Measured sperm motility and motion parameters 30
• 5. Enzyme-linked immunosorbent assay 31
• 6. Statistical analysis 32
• C. RESULTS 33
• 1. Differences in sperm motion parameters between the control and E.O treatment groups 33
• 2. Correlation between Rab proteins and sperm motion parameters 35
• 3. Correlation between sperm motion parameters and Rab3A 38
• 4. Correlation between sperm motion parameters and Rab5 41
• 5. Correlation between sperm motion parameters and Rab14 43
• 6. Correlation between sperm motion parameters and Rab25 46
• 7. Correlation between sperm motion parameters and Rab27A 49
• 8. Correlation between sperm motion parameters and Rab34 51
• D. DISCUSSION 53
• GENERAL CONCLUSION 57
• REFERENCES 59
• ABSTRACT 66
• 국문 초록 69