흑호두과피 추출물의 미백활성에 대한 연구 = Investigation of the Whitening Activity of Black Walnut Hull Extract

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study aimed to investigate the skin-whitening potential of Juglans
nigra (black walnut) hull extract as a natural agent capable of inhibiting
UV-induced skin inflammation and melanin biosynthesis. Although Juglans
nigra hulls are reported to possess antioxidant and anti-inflammatory
activities due to their rich content of bioactive compounds such as
phenolics, flavonoids, and tocopherols, specific research on their
regulatory mechanisms regarding melanin biosynthesis remains limited.
Therefore, this study analyzed the inhibitory effects of Juglans nigra hull
hot-water extract on the expression of melanogenesis-related enzymes—
Tyrosinase, TRP-1, and TRP-2—and the transcription factor MITF in
B16F10 melanoma cells. Treatment of α-MSH-stimulated B16F10
melanoma cells with the extract resulted in a significant,
concentration-dependent reduction in melanin synthesis within the range
of 0.1, 1, and 10 μg/mL. Cell viability assessment via MTT assay
indicated a significant decrease at concentrations of 62.5 μg/mL and
above; however, no cytotoxicity was observed in the range of 15.6–31.2
μg/mL, which was subsequently established as the effective concentration
range. Furthermore, measurement of intracellular tyrosinase inhibitory
activity demonstrated excellent inhibition within this non-toxic
concentration range, confirming its potential as a whitening agent. To
further elucidate the mechanism underlying melanogenesis inhibition,
RT-PCR and Western blot analyses were conducted. RT-PCR results
revealed that the extract did not show a significant inhibitory effect on α
-MSH-induced MITF mRNA expression at 6 and 24 hours. However, the
mRNA expression of downstream enzyme genes, such as Tyrosinase,
TRP-1, and TRP-2, was reduced at the 24-hour time point. In contrast,
Western blot analysis confirmed a decrease in the protein levels of MITF,
Tyrosinase, TRP-1, and TRP-2. These findings suggest that the extract
inhibits melanogenesis primarily by regulating enzyme expression and
activity, likely through post-transcriptional mechanisms affecting MITF
protein stability or translation, rather than at the initial transcriptional
regulatory stage. In conclusion, this study confirms the high potential of
Juglans nigra hull extract as a natural skin-whitening agent for application
in the cosmetic and pharmaceutical industries, capable of effectively
inhibiting melanin biosynthesis while simultaneously mitigating UV-induced
oxidative stress and inflammatory responses.

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 흑호두(Juglans nigra) 과피(shell)를 추출하여 자외선(UV)으로 유 도되는 피부 염증 및 멜라닌 생합성을 억제할 수 있는 천연 유래 소재에 대한 미백 활성 가능성을 확인하고자 하였다. 흑호두 과피는 페놀류, 플라보노이드, 토코페롤 등 다양한 생리활성 성분을 함유하고 있어 항산화 및 항염 활성이 보고 된 바 있으나, 멜라닌 생합성 조절 기전에 대한 구체적인 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 흑호두 과피 열수 추출물을 이용하여 B16F10 melanoma cell에서 멜라닌 생성 관련 효소인 Tyrosinase, TRP-1, TRP-2 및 전사인자 MITF의 발현 억제 효과를 분석하였다. α-MSH로 멜라닌 생성을 유도한 B16F10 melanoma cell에 흑호두 과피 추출물을 처리하여 멜라닌 생성 억제 효능을 확인한 결과, 0.1, 1, 10 μg/mL 농도 범위에서 농도 증가에 따라 멜라닌 생성이 유의적으로 감소하였다. MTT assay 를 통해 세포 생존율을 측정한 결과 62.5 μg/mL 이상의 농도에서는 세포 생존율이 유의하게 감소하였으나, 15.6 –31.2 μg/mL 범위에서는 세포 독성이 관찰 되지 않아 이를 유효 농도로 설정하였다. 또한 세포 내 tyrosinase 저해 활성 측정 결과, 동일한 비독성 농도 범위에서 우수한 저해 활성을 보여 미백 소재로서 의 가능성을 확인하였다. 본 추출물의 멜라닌 생성 억제 기전을 확인하기 위해 RT-PCR 및 Western blot 분석을 수행하였다. RT-PCR 결과, 흑호두 과피 추출물은 α-MSH 자극에 의해 증가된 MITF의 mRNA 발현을 6시간 및 24시간 시점에서 유의한 억제 효과를 보이지 않았으나, Tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 같은 하위 효소 유전자의 mRNA 발현은 24시간 시점에서 감소하였다. Western blot 분석에서는 MITF, Tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 수준이 감소하는 모습이 확인되어, 본 추출물이 melanogenesis의 초기 전사조절 단계보 다는 효소 발현 및 활성을 중심으로 멜라닌 생합성을 억제할 가능성을 보여주었 다. 이상의 결과로부터 흑호두 과피 추출물은 자외선으로 인한 산화 스트레스 및 염증 반응을 완화함과 동시에 멜라닌 생합성을 효과적으로 억제할 수 있는 천연 유래 미백 활성 소재로서 화장품 및 의약외품 분야에서의 활용 가능성을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• 그림 목차 ⅲ
• 표 목차 ⅳ
• 약어 목록 ⅴ
• 국문 초록 ⅶ
• 1. 서론 1
• 2. 재료 및 방법 5
• 가. 재료 5
• 1) 시료 5
• 2) 시약 및 기기 6
• 나. 방법 7
• 1) 멜라닌 생성 억제에 대한 스크리닝 7
• 2) 세포배양 8
• 3) 세포 생존율 측정 9
• 4) 세포 내 tyrosinase 저해 활성 측정 10
• 5) RT-PCR 11
• 6) Western blot 13
• 7) 통계분석 15
• 3. 연구결과 16
• 가. 미백활성 효과 분석 16
• 1) B16F10 세포의 멜라닌 함량에 대한 흑호두 과피의 효과 16
• 2) 세포 독성 20
• 3) Tyrosinase 저해 활성 22
• 4) MITF, Tyrosinase, TRP-1, TRP-2 유전자 발현 억제 24
• 5) MITF protein 발현 억제 27
• 6) Tyrosinase, TRP-1, TRP-2 protein 발현 억제 30
• 4. 고찰 35
• 5. 결론 38
• 참고문헌 39
• Abstract(영문초록) 42