장쇄 지방산 처리에 따른 심근세포의 대사적 성숙 과정의 정량적 평가 = Quantitative Assessment of Contractility of Immature Cardiomyocytes Treated with Long-Chain Fatty Acids

국문 초록 (Abstract)

심근세포의 성숙은 심장 발달과 기능 유지에 필수적인 과정으로, 대사·전기적·구조적 성숙이 통합적으로 이루어져야 한다. 그러나 배양 환경에서 확보되는 미성숙 심근세포는 성체 심근세포와 비교해 기능적 안정성이 떨어지며, 이는 질환 모델링 및 약물 평가에서 중요한 한계로 작용한다. 본 연구에서는 장쇄 지방산(long-chain fatty acids, LCFAs)과 교감신경계 호르몬인 노르에피네프린(Norepinephrine, NE)이 신생 랫드 심실 유래 심근세포(neonatal rat ventricular myocytes, NRVMs)의 성숙에 미치는 효과를 체계적으로 평가했다. 이를 위해 SU-8 기반 마이크로캔틸레버와 마이크로전극 배열(microelectrode array, MEA)을 이용하여 장기간에 걸쳐 수축 운동과 전기적 활동을 모니터링했으며, qPCR, Western blot, 면역세포화학 염색, 홀로토모그래피를 통해 대사 및 구조적 성숙 지표를 분석했다. 그 결과, 올레산(Oleic acid, OA)과 감마-리놀렌산(Gamma-linolenic acid, GLA) 병용 처리 시 amplitude, contraction rate, field potential amplitude 및 duration, 지방산 산화(Fatty acid oxidation, FAO) 관련 유전자와 단백질 발현이 모두 유의미하게 향상되었다. 그러나 LCFA 단독 처리군에서는 장기 배양 시 contraction rate 가 점차 저하되는 경향이 나타났으며, 이러한 현상은 NE 를 병용했을 때 억제되어 장기간 안정적인 수축 활동이 유지되었다. 특히 NE 와 OA 를 함께 처리한 경우 장기적인 기계적·전기적 성숙 효과가 가장 뚜렷하게 확인되었으며, NE+GLA+OA 조건에서는 추가적인 상승 경향이 관찰되었다. 이러한 결과는 LCFA 와 NE 가 서로 다른 경로를 통해 작용하되, 공통적으로 PGC-1α–PPARα 축에서 수렴하여 대사·전기·구조적 성숙을 촉진함을 시사한다. 본 연구는 지방산과 교감신경계 자극인자의 병용 처리가 미성숙 심근세포의 통합적 성숙을 유도할 수 있음을 규명했으며, hiPSC-CM 성숙 연구, 심근 질환 모델링, 약물 반응성 평가 및 재생의학적 응용에 기여할 수 있는 전략적 기반을 제시했다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Maturation of cardiomyocytes is an essential process for heart development and
functional stability, requiring the integration of metabolic, electrical, and structural remodeling.
However, immature cardiomyocytes maintained under in vitro culture conditions exhibit
reduced functional stability compared to adult cardiomyocytes, limiting their utility in disease
modeling and pharmacological testing. In this study, we systematically investigated the effects
of long-chain fatty acids(LCFAs) and the sympathetic neurotransmitter norepinephrine(NE)
on the maturation of neonatal rat ventricular myocytes(NRVMs). SU-8–based
microcantilevers and microelectrode arrays(MEAs) were employed for long-term monitoring
of contractile force and electrophysiological activity, while qPCR, Western blotting,
immunocytochemistry, and holotomography were used to assess metabolic and structural
maturation markers. Our results demonstrated that combined treatment with oleic acid(OA)
and γ-linolenic acid(GLA) significantly enhanced contractile amplitude, contraction rate, field
potential amplitude and duration, and the expression of genes and proteins associated with
fatty acid oxidation(FAO). In contrast, NRVMs treated with LCFAs alone exhibited a
progressive decline in contraction rate during long-term culture; this decline was effectively suppressed when NE was co-administered, resulting in sustained contractile activity. Notably,
co-treatment with NE and OA produced the most pronounced improvements in mechanical
and electrical maturation, and the combination of NE, OA, and GLA showed an additional
upward trend. These findings indicate that LCFAs and NE act through distinct pathways but
converge on the PGC-1α–PPARα regulatory axis to promote integrated metabolic, electrical,
and structural maturation. Collectively, this study demonstrates that co-stimulation with
LCFAs and NE effectively induces functional maturation of immature cardiomyocytes,
providing a strategic basis for advancing hiPSC-CM maturation research, cardiac disease
modeling, drug responsiveness testing, and regenerative medicine applications

목차 (Table of Contents)

• 1. 서 론 1
• 1.1. 심근세포 성숙의 생리학적 중요성. 1
• 1.2. 심근세포 발달 과정과 대사 전환 2
• 1.3. 지방산과 부신 수질 호르몬의 생리학적 역할 3
• 1.4. 기존 성숙 유도 접근법과 한계점 6
• 1.5. 연구 목표와 전략 8
• 2. 재료 및 방법 10
• 2.1. Neonatal rat ventricular myocyte (NRVM) 분리 및 배양 10
• 2.2. 영상 녹화를 통한 NRVM 수축 운동 이미징 11
• 2.3. SU-8 Microcantilever 제작 및 수축 변위 측정 13
• 2.4. Microelectrode array (MEA) 제작과 field potential 측정 14
• 2.5. 수축 profile 및 filed potential profile 분석 방법 16
• 2.6. Western blot 18
• 2.7. RT-qPCR analysis 20
• 2.8. Immunocytochemistry (ICC) 22
• 2.9. Holotomography (HT) 이미징 22
• 2.10. 통계 분석 23
• 3. 결과 24
• 3.1. Neonatal rat cardiac fibroblast 배양 24
• 3.2. 지방산 처리 조건 탐색을 통한 배양 환경 최적화 25
• 3.3. 캔틸레버를 통한 장쇄 지방산 처리 시 수축 운동 변화 27
• 3.4. MEA를 통한 장쇄 지방산 처리 시 field potential 변화 29
• 3.5. 장쇄 지방산 처리 시 대사적 변화 분석 31
• 3.6. ICC를 통한 LCFA 처리 시 구조적 성숙 분석 32
• 3.7. HT를 통한 세포 내 lipid droplet(LD) 변화 분석 34
• 3.8. 영상 촬영을 통한 NE 처리 시 수축 운동 변화 36
• 3.9. 캔틸레버를 통한 NE 처리 시 수축 운동 변화 37
• 3.10. NE에 의한 field potential 변화 39
• 3.11. NE에 의한 대사적 변화 분석 41
• 3.12. NE에 의한 구조적 성숙 분석 43
• 3.13. 장쇄 지방산과 NE 처리에 따른 NRVM 성숙 비교 44
• 4. 고찰 46
• 4.1. 장쇄 지방산에 의한 심근세포 대사 성숙 조절의 장기적 기능 분석 46
• 4.2. 지방산 기반 대사 조절과 교감신경계 호르몬의 병용 자극 효과 46
• 4.3. 방법론적 고찰 및 한계. 48
• 4.4. 향후 연구 계획 49
• 4.5. 인간 심근세포로의 확장 적용 가능성 50
• 5. 결론 52
• 참고 문헌 53
• Abstract in English(영문 초록) 57
• 부록 59
• A.1. 1차년도 동물실험승인서(CNU IACUC-YB-2024-56) 59
• A.2. 2차년도 동물실험승인서(CNU IACUC-YB-2025-103) 60
• A.3. 동물실험교육 수료증 61
• A.4. XFe96 analyzer 분석 프로토콜 62
• 감사의 글 65
• 이력서(C.V.) 67