북방전복, Haliotis discus hannai Arginine kinase 분자구조 분석 및 기능 = Molecular cloning characterization and expression analysis of Arginine Kinase in Pacific abalone, Haliotis discus hannai

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 북방전복 (Haliotis discus hannai)의 소화샘 조직에서 Arginine Kinase (AK) 유전자의 full-length 서열 (Hdh-AK)를 클로닝하고, 분자적 특성과 발현 양상을 분석하였다. AK는 무척추동물 특이적인 인산전달 효소로, 다양한 에너지 대사과정에 관여하며 근육 수축, ATP 생성 및 에너지 전달과 같은 생리적 기능에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. Hdh-AK의 open reading frame (ORF)은 1,068 bp로 총 355개의 아미노산을 암호화하며, 이 중 9개의 시스테인 잔기가 확인되었다. 물리화학적 특성 분석에서 Hdh-AK의 분자량은 39.81 kDa, 등전점 (pI)은 6.34로 예측되었다. 단백질 상동성 분석 결과, Hdh-AK는 H. rufescens의 AK와 가장 높은 유사성(99.43% identity)을 보였으며, 계통수 분석에서도 H. rufescens 및 H. rubra와 가까운 진화적 관계를 형성하는 것으로 나타났다. qRT-PCR 결과, Hdh-AK의 발현은 소화샘 (DG)에서 가장 높았으며, 정소 (TES)와 근육 (Mus) 순으로 비교적 높은 발현이 관찰되었다 (P < 0.05). 절식 조건에서 Hdh-AK 발현은 시간이 경과 함에 따라 점진적으로 증가하여 3주 차에 최고 수준에 도달하였으며, 재급이 (RF) 후 발현이 다소 감소하였다. 또한 고온 스트레스 (30℃) 노출 하에서 노출 3시간 후 발현 증가하여 6시간 경과 시점까지 높은 수준을 유지하였으며 이후 시간 경과에 따라 점차 감소하는 양상을 나타내었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study was performed to investigate the cloning, molecular characterization and expression patterns of arginine kinase (AK) in H. discus hannai. AK is an invertebrate-specific glycoprotein that plays a crucial role in physiological functions such as muscle contraction, ATP production, and energy transfer. The full length cDNA of Hdh-AK was cloned from H. discus hannai, and the open reading frame (ORF) is 1,068 bp in length, encoding a polypeptide of 355 amino acids, including nine cysteine residues. The Hdh-AK nucleotide has a calculated molecular mass of 39.81 kDa, and a theoretical isoelectric point (pI) of 6.34.
Protein homology analysis revealed that Hdh-AK shares the highest identity (99.43%) with Hrf-AK from H. rufescens. Consistently, phylogenetic analysis indicated a close evolutionary relationship between among Hdh-AK, Hrf-AK, and Hrb-AK (H. rubra). qRT-PCR analysis showed that Hdh-AK was expressed in all examined tissues, with the highest expression in the digestive gland (P < 0.05), followed by testis, and muscle. During the fasting period, Hdh-AK expression in the digestive gland gradually increased and peaked at 3 weeks, then decreased after refeeding. In addition, under high-temperature stress (30°C), the mRNA expression level of Hdh-AK reached a maximum at 3 hours of exposure and subsequently decreased over time.

목차 (Table of Contents)

• 1. 서론 1
• 2. 재료 및 방법 3
• 가. 동물실험윤리 3
• 나. 실험동물 3
• 다. qRT-PCR을 위한 시료 채취 3
• 1) 조직별 샘플 채취 3
• 2) 30℃ 수온 스트레스 노출 시간별 샘플 채취 3
• 3) 절식 기간별 샘플 채취 4
• 라. Hdh-AK full length sequence 클로닝 4
• 1) tRNA 추출 및 cDNA 합성 4
• 2) Hdh-AK partial sequence 4
• 3) 5'/3' Rapid amplification of cDNA ENDS (RACE) sequence 5
• 마. Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) 6
• 바. Hdh-AK의 생물정보학(Bioinformatics) 분석 6
• 사. 분자계통수 (Phylogenic tree) 분석 7
• 아. 3차원 (3D) 입체구조 분석 8
• 자. 통계분석 및 그래프 제작 8
• 3. 결 과 10
• 가. Hdh-AK sequence 분석 결과 10
• 나. Hdh-AK 생물정보학 분석 결과 13
• 1) 단백체학 (Proteomics) 분석 결과 13
• 2) 3차원 (3D) 입체구조 분석 결과 15
• 3) 다중 정렬 (Multiple alignment) 분석 결과 16
• 4) Motif scan 분석 결과 17
• 5) 상동성(homology) 분석 결과 19
• 6) 계통수(Phylogenetic tree) 분석 결과 21
• 다. Hdh-AK의 qRT-PCR 분석 결과 24
• 1) 조직별 Hdh-AK mRNA 발현 수준 24
• 2) 절식 기간별 Hdh-AK 발현 수준 25
• 3) 30℃ 수온 스트레스 노출 시간별 Hdh-AK 발현 수준 26
• 4. 고 찰 27
• 참고문헌 30
• Abstract 34
• 감사의 글 36