넙치에서 viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) 감염에 따른 면역유전자 발현 패턴 비교 = Comparative Analysis of Immune Gene Expression Patterns in Olive Flounder (Paralichthys olivaceus) Following Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV) Infection

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 넙치(Paralichthys olivaceus) 양식 산업에서 심각한 경제적 손실을 초래하는 바이러스성 출혈성 패혈증(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV) 감염에 따른 초기 면역유전자 발현 패턴을 규명하는 것을 목적으로 수행되었다. VHSV는 RNA 바이러스로, 주로 저수온기(약 4–14℃)에 발생하며 감염 시 높은 폐사율을 유발하는 세계동물보건기구(World Organisation for Animal Health, WOAH) 지정 관리 대상 질병이다. VHSV 감염 이력이 없는 넙치를 대상으로 실험군과 대조군으로 나누어, 실험군에는 VHSV (10⁷ TCID50/0.1 mL)를 복강 주사하고, 대조군에는 동일 용량의 MEM (Minimum Essential Medium) 배지를 접종하였다. 접종 2일 차와 3일 차에 신장과 비장 조직을 채취하여 RNA를 추출하고 cDNA를 합성한 후 qPCR을 통해 바이러스 역가와 면역유전자(tlr3, tlr9, igm, il1β, casp6)의 상대적 발현을 비교 분석하였다. 바이러스 정량 분석 결과, 대조군에서는 VHSV가 검출되지 않았으며 실험군에서는 2일 차 1.25 × 10⁶ copies/mL, 3일 차 6.13 × 10⁶ copies/mL로 약 4.9배 증가하였다. 면역유전자 발현 결과, igm이 2일 차에 27.67배, 3일 차에 34.23배로 가장 높은 증가를 보였으며, casp6도 2일 차 3.06배, 3일 차 7.36배로 증가하였다. tlr3와 il1β는 2일 차에 각각 7.48배, 8.34배로 증가한 후 3일 차에는 다소 감소하는 경향을 나타냈고, tlr9는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 종합적으로, 넙치에서 VHSV 감염 초기 단계에서 바이러스 농도는 빠르게 증가하며 다양한 면역 경로가 서로 상이한 양상으로 작동함을 보여주었다. 이와 같은 tlr 발현의 차이는 VHSV가 RNA 바이러스라는 점에서 각 Tlr별 병원체 인식 경로의 차이가 반영된 결과로 판단되며, tlr3와 il1β의 3일 차 발현 감소에 대해서는 시점과 기작에 대한 추가적인 분석이 필요하다. 본 연구 결과는 VHSV 감염 초기 단계에서 넙치의 면역 반응 특성을 이해하는 데 중요한 기초 자료를 제공하며 향후, 초기 진단법 개발과 백신 후보 평가 및 질병 예방 관리 전략 수립에 활용될 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study aimed to investigate the early immune gene expression patterns in olive flounder (Paralichthys olivaceus) in response to infection with viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV), which causes significant economic losses in the aquaculture industry. VHSV is an RNA virus that primarily occurs at low water temperatures (approximately 4–14°C) and is classified as a notifiable disease by the World Organisation for Animal Health (WOAH) due to its high mortality rate. Olive flounders with no prior history of VHSV infection were divided into experimental and control groups. The experimental group was intraperitoneally injected with VHSV (10⁷ TCID50/0.1 mL), while the control group received an equivalent volume of MEM (Minimum Essential Medium). Kidney and spleen tissues were collected at 2 and 3 days post-injection, and RNA was extracted and reverse-transcribed into cDNA. Quantitative PCR (qPCR) was performed to compare viral load and the relative expression of immune genes (tlr3, tlr9, igm, il1β, and casp6). Viral quantification revealed no VHSV in the control group, whereas the experimental group showed an increase from 1.25 × 10⁶ copies/mL on day 2 to 6.13 × 10⁶ copies/mL on day 3, representing a 4.9-fold rise. Among immune genes, igm exhibited the highest upregulation, with 27.67-fold on day 2 and 34.23-fold on day 3, while casp6 increased 3.06-fold and 7.36-fold, respectively. tlr3 and il1β were upregulated on day 2 (7.48- and 8.34-fold) but showed a slight decrease on day 3, whereas tlr9 expression remained unchanged. Overall, VHSV infection in olive flounder induced a rapid increase in viral load and distinct patterns of immune gene activation. The differential tlr expression likely reflects the RNA viral nature of VHSV, and the decrease in tlr3 and il1β expression on day 3 warrants further investigation into the timing and mechanisms of this regulation. These findings provide fundamental data for understanding the early immune responses of olive flounder to VHSV infection and may serve as a basis for developing early diagnostic methods, evaluating vaccine candidates, and establishing disease prevention and management strategies.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 4
• 1. 실험어 및 실험조건 4
• 2. VHSV 역가 측정 및 접종 4
• 3. 시료 채취 5
• 4. RNA 추출 및 cDNA 합성 5
• 5. qPCR 분석 5
• 5.1. VHSV 절대 정량 분석 5
• 5.2. 면역유전자 상대 발현 분석 6
• Ⅲ. 결과 10
• 1. VHSV 역가 측정 10
• 2. 대조군 및 실험군 폐사 관찰 10
• 3. qPCR 분석 12
• 3.1. VHSV 절대 정량 분석 12
• 3.2. Housekeeping gene 발현 분석 13
• 3.3. 면역유전자 Ct 값 분석 13
• 3.4. 면역유전자 상대 발현 분석(2⁻ΔΔCt) 15
• Ⅳ. 고찰 18
• 참고문헌 24
• Abstract(영문초록) 32