Transcriptional Programs Mediating the Effects of Lactic Acid Bacteria on Liver Function in Obesity and Aging = 비만과 노화에서 유산균의 간 기능에 미치는 영향을 매개하는 전사 프로그램

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), a chronic liver disease which characterizes excessive fat accumulation in hepatocytes regardless of alcohol intake, is currently the most common disease with a prevalence of approximately 25-30% of the global population. Aging and high-fat diet (HFD) are major risk factors for NAFLD, both characterized by disrupted lipid metabolism, mitochondrial dysfunction, and insulin resistance. Although several Lactobacillus species. have been shown to ameliorate hepatic steatosis, the molecular mechanisms underlying their hepatoprotective effects remain poorly understood. In this study, I identified that administration of Lactobacillus johnsonii LJ3402 markedly alleviates HFD- and age-induced hepatic dysfunction through dual regulation of lipid metabolism and mitochondrial homeostasis.
LJ3402 suppressed hepatic lipogenesis by promoting PKA-dependent phosphorylation and inactivation of SREBP-1c, thereby reducing the expression of its target genes, including Fasn and Acc. Consistently, inhibition or silencing of PKA abolished LJ3402-induced SREBP-1c phosphorylation and its lipogenic repression in hepatocytes. In parallel, LJ3402 improved systemic insulin sensitivity, reduced hepatic and circulating triglyceride and free fatty acid levels, and lowered plasma ALT and AST, indicating protection against diet-induced lipotoxic stress. Furthermore, administration of LJ3402 increased plasma lactate levels in mice, and lactate, a metabolite of LJ3402, enhanced phosphorylation of SREBP-1c while suppressing its transcriptional activity in AML12 hepatocytes. These results suggested that LJ3402-induced activation of PKA may inhibit intracellular lipid accumulation through repression of SREBP-1c transcriptional activity, and lactate, a metabolite, plays a role as signaling factor rather than a simple by-product.
Next, given that diet-induced metabolic abnormality is closely linked to age-associated metabolic dysfunction, I investigated the effects of LJ3402 on hepatic functional decline and intracellular molecular mechanisms during aging. Administration of LJ3402 maintained hepatic function by ameliorating mitochondrial dysfunction and alleviating hepatocyte senescence via activation of the PGC-1α-SIRT1 axis. Mechanistically, LJ3402 stimulated the PPARα-coactivation of PGC-1α, leading to increasing SIRT1 expression, and the effect of LJ3402 on SIRT1 transcription was further enhanced by PGC-1, which is deacetylated by SIRT1, indicating the establishment of a positive regulatory feedback loop between PGC-1α and SIRT1. Consequently, SIRT1 improved mitochondrial function, inhibited cellular senescence, and attenuated age-related hepatic steatosis through deacetylation of both PGC-1α and p53. Interestingly, this study further identified C/EBPα, liver-enriched transcription factor, as a critical downstream effector of this pathway. Activation of SIRT1 by resveratrol facilitated the deacetylation of C/EBPα, thereby enhancing its binding to the PGC-1α promoter and increasing PGC-1α expression in AML12 hepatocytes. Mutation analysis using K159/299Q and K159/299R variants demonstrated that deacetylation at lysine residues K159 and K299 is essential for C/EBPα-induced PGC-1α expression and mitochondrial gene activation. Moreover, under SIRT1 activation, PGC-1α directly interacted with C/EBPα and acted as a coactivator to promote its own transcription, establishing a positive autoregulatory loop. These findings indicate that C/EBPα functions as a molecular amplifier of the SIRT1–PGC-1α axis, thereby maintaining mitochondrial and metabolic homeostasis in senescent hepatocytes. Hepatic knockdown of C/EBPα using siRNA in D-galactose–induced aged mice abolished the beneficial effects of resveratrol on mitochondrial function, hepatic lipid content, and liver parameters, suggesting that C/EBPα mediates the metabolic protective actions of SIRT1.
Collectively, this study demonstrates that LJ3402 exerts broad hepatoprotective effects by targeting key pathways involved in lipid metabolism and cellular senescence, highlighting its potential as a probiotic intervention for the prevention of obesity- and age-related NAFLD

국문 초록 (Abstract)

비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)은 알코올 섭취와 관계없이 간세포 내 과도한 지방 축적되는 만성 간 질환으로, 현재 전 세계 성인 인구의 약 20-30%의 유병률을 보이는 가장 흔한 대사 질환이다. 고지방 식단 또는 노화는 NAFLD의 주요 위험 요인으로, 지질 대사 장애, 미토콘드리아 기능 장애, 인슐린 저항성을 특징으로 한다. 여러 Lactobacillus species. 가 간 지방증을 개선하는 것으로 보고되고 있지만, 이들의 간 보호 효과에 대한 분자 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않고 있다. 본 연구에서 Lactobacillus jonsonii JNU3402 (LJ3402)의 투여가 지질 대사 및 미토콘드리아 항상성 조절을 통해 고지방 식이 및 노화에 의한 간 기능 장애를 완화한다는 것을 확인했다. LJ3402는 PKA 의존적 인산화를 통한 SREBP-1c의 활성을 억제함으로써 Fasn과 Acc를 포함한 표적 유전자의 발현을 감소시켜 간 지방 생성을 감소시켰다. 일관되게, PKA의 활성 억제 또는 발현 억제는 간 세포에서 LJ3402에 의해 유도된 SREBP-1c 인산화와 지방 생성 억제 효과를 제거했다. 동시에 LJ3402는 인슐린 감수성을 개선하고, 간 및 순환 중성지방과 유리 지방산 수치를 감소시켰으며, 혈장 ALT와 AST를 낮추어 고지방 식이에 의한 지방독성 스트레스에 대한 간 조직 보호 효과를 나타냈다. 또한 LJ3402의 투여는 마우스 혈장에서 젖산 수치를 높였으며, LJ3402의 대사체인 젖산은 AML12 간세포에서 SREBP-1c의 인산화를 증가시키고 전사활성을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 LJ3402에 의한 PKA의 활성화가 SREBP-1c의 전사활성 억제를 통해 간세포 내 지질 축적을 억제할 수 있음과 더불어 대사체인 젖산이 단순 부산물이 아닌 신호인자로서 역할을 한다는 것을 암시한다. 다음으로, 식이 유도 대사 이상은 연령 관련 대사 이상과 밀접하게 연관되어 있으므로, 노화에 따른 간 기능 변화 및 세포 내 분자 메커니즘에 대한 LJ3402의 효과에 대해 연구하였다.
LJ3402의 투여는 PGC-1α-SIRT1 축을 활성화함으로써 미토콘드리아 기능 이상을 개선하고 간세포 노화를 완화하여 간 기능을 유지하였다. 기계적으로, LJ3402는 PGC-1α의 PPARα 공동 활성화를 자극하여 SIRT1의 발현을 증가시켰고, SIRT1 전사에 대한 LJ3402의 효과는 SIRT1에 의해 탈아세틸화된 PGC-1α에 의해 더욱 강화되었으며, 이는 PGC-1α과 SIRT1 사이에 양성 조절 루프가 확립된다는 것을 시사한다. 그 결과, SIRT1은 PGC-1α와 p53의 탈아세틸화를 통해 미토콘드리아 기능 개선, 세포노화 억제, 연령 관련 간 지방증을 완화하였다.
흥미롭게도, 본 연구에서는 간에 풍부한 전사 인자인 C/EBPα가 이 경로의 중요한 하류 효과자로 작용한다는 것을 추가로 찾아냈다. AML12 간세포에서 Resveratrol에 의한 SIRT1의 활성화는 C/EBPα 탈아세틸화를 촉진하여 PGC-1α 프로모터 결합을 유도함으로써 PGC-1α의 발현을 증가시켰다. K159/299Q와 K159/299R을 사용한 돌연변이 분석 결과, 159번, 299번 라이신 잔기의 아세틸레이션 상태가 C/EBPα에 의한 PGC-1α 발현과 미토콘드리아 유전자 조절에 중요하다는 것이 확인되었다. 또한, PGC-1α는 SIRT1 활성화 하에서 C/EBPα와 직접적인 상호작용을 통해 공동 활성자로써 역할 하여 스스로의 발현을 조절하는 양성 자가 조절 루프를 확립했다. 이는 C/EBPα가 SIRT1-PGC-1α 축의 분자 증폭자로서 기능하여 노화된 간세포에서 미토콘드리아 및 대사 항상성을 유지함을 시사한다. D-galactose 유도 노화 마우스에서 siRNA를 이용하여 간에서 C/EBPα의 발현 억제는 resveratrol 투여에 대한 미토콘드리아 기능 개선, 간 지질 성분 감소, 간기능 지표 개선과 같은 효과를 제거하였고, 이는, C/EBPα가 SRIT1 매개 대사 보호의 매개체임을 시사한다.
종합적으로, 본 연구는 LJ3402가 지질 대사 및 세포 노화의 경로를 표적으로 삼아 광범위한 간 보호 효과를 제공한다는 것을 입증하였으며, 비만 및 연령 관련 NAFLD 예방을 위한 프로바이오틱 전략으로서 잠재력을 보여준다.

목차 (Table of Contents)

• Content 1
• List of Figure 4
• List of tables 6
• List of Abbreviations 7
• Abstract 9
• Background 13
• Chapter Ⅰ. Lactobacillus johnsonii JNU3402 protects against diet-induced hepatic steatosis in HFD-fed mice through the PKA-SREBP1c pathway 31
• Introduction 32
• Material and Methods 35
• Results 40
• 1. LJ3402 suppresses body weight gain in HFD-fed mice 40
• 2. LJ3402 improves diet-induced insulin resistance 42
• 3. LJ3402 reduces hepatic lipid accumulation in HFD-fed mice 44
• 4. LJ3402 inhibits lipid accumulation by regulating SREBP-1c expression and activity 46
• 5. LJ3402 regulates the phosphorylation level of SREBP-1c through activation of the PKA pathway 50
• 6. LJ3402 suppresses SREBP-1c transcriptional activity by inducing PKA-dependent phosphorylation 53
• 7. Lactate serves as a key mediator of LJ3402-driven suppression of SREBP-1c activity and hepatic lipid accumulation 56
• Discussion 60
• Chapter Ⅱ. Lactobacillus johnsonii JNU3402 protects against age-related hepatic dysfunction via the PGC-1αSIRT1p53/C/EBPα Axis 62
• Introduction 63
• Material and Methods 69
• Results 76
• 1. LJ3402 protects against senescence in aged mice liver 76
• 2. LJ3402 alleviates age-related hepatic lipid accumulation 80
• 3. LJ3402 enhances SIRT1 expression in AML12 hepatocytes through the PGC-1αPPARα pathway 82
• 4. LJ3402 enhance hepatic mitochondrial function by establishing a positive regulatory loop between PGC-1α and SIRT1 86
• 5. LJ34202 attenuates H2O2-induced hepatocyte senescence through SIRT1-mediated deacetylation of p53 90
• 6. LJ3402 ameliorates H2O2-induced hepatic lipid accumulation by stimulating PGC-1α-mediated inhibition of mitochondrial dysfunction 93
• 7. LJ3402 delays aging-induced functional decline in mice 95
• 8. SIRT1-driven deacetylation of C/EBPα reverses senescence-induced transcriptional reprogramming in AML12 hepatocytes 100
• 9. Deacetylated C/EBPα acts as a key mediator of SIRT1-dependent PGC-1α transcription 103
• 10. C/EBPαPGC-1α axis regulates mitochondrial homeostasis in a SIRT1-dependent manner 106
• 11. SIRT1-mediated deacetylation of C/EBPα enhances interaction with PGC-1α and promotes autoregulatory expression 110
• 12. C/EBPα is required for resveratrol-mediated improvement of hepatic lipid metabolism and mitochondrial function in D-gal-induced aged mice 113
• Discussion 118
• References 122
• Abstract in Korean 138