Scleroderolide에 의한 대장암 억제 효능 규명 = Anti-cancer activities of Scleroderolide in colorectal cancer

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Colorectal cancer remains one of the leading causes of cancer-related mortality worldwide, highlighting the need for novel anticancer strategies with reduced cytotoxicity and improved therapeutic selectivity. In this study, we investigated the anticancer effects and underlying molecular mechanisms of scleroderolide, a natural compound isolated from Penicillium sp. EML-48, in murine colorectal cancer MC38 cells. Scleroderolide significantly inhibited cell proliferation without inducing apoptosis, indicating a non-cytotoxic mode of action. Cell cycle analysis revealed that scleroderolide induced S-phase arrest, which was accompanied by downregulation of cyclin A2 and cyclin D1. In addition, scleroderolide treatment resulted in decreased expression of p27 and increased activation and phosphorylation of p53, suggesting that aberrant S-phase entry and subsequent p53 pathway activation may be associated with the observed cell cycle arrest. Scleroderolide also increased intracellular reactive oxygen species (ROS) levels, which may contribute to DNA damage–mediated p53 activation. Furthermore, scleroderolide induced cellular senescence, as evidenced by increased SA-β-gal activity, formation of senescence-associated heterochromatin foci, and changes in cell size and granularity. Notably, the expression of senescence-associated secretory phenotype (SASP)–related inflammatory cytokines and chemokines was significantly reduced, consistent with features of p53-dependent senescence. In addition, scleroderolide modulated immune-related molecules by upregulating MHC class I expression and differentially regulating PD-L1 expression. Autophagy-related gene expressions, including Bec1, LC3B, and p62, were decreased following scleroderolide treatment, which may be associated with the maintenance of the senescent state. Taken together, these findings demonstrate that scleroderolide suppresses colorectal cancer cell proliferation by inducing p53-mediated S-phase arrest and cellular senescence without cytotoxicity, suggesting its potential as a promising anticancer candidate targeting cell cycle regulation and senescence.

국문 초록 (Abstract)

대장암은 전 세계적으로 높은 발병률과 사망률을 보이는 주요 암종으로, 기존의 수술, 방사선 및 화학요법은 비선택성, 약물 내성 및 장기적 부작용 등의 한계를 지닌다. 이에 따라 낮은 독성과 새로운 작용 기전을 갖는 항암 후보 물질의 개발이 요구되고 있으며, 곰팡이 유래 2차 대사산물은 이러한 요구를 충족할 수 있는 유망한 천연 자원으로 주목받고 있다. 본 연구에서는 Penicillium sp. EML-48로부터 분리된 17종의 단일 화합물을 대상으로 마우스 대장암 세포주 MC38에서 항암 활성을 평가하였으며, 그중 scleroderolide가 세포 독성 없이 세포 증식을 효과적으로 억제함을 확인하였다. Scleroderolide는 cyclin A2와 cyclin D1의 발현을 억제 하고 p53 경로를 활성화함으로써 S기 세포주기 정지를 유도하였으며, 이 과정에서 p27 및 c-myc의 발현 감소와 세포 내 ROS 축적이 동반되었다. 또한 scleroderolide는 apoptosis를 유도하지 않고, SA-β-gal 활성 증가, SAHF 형성, 세포 크기 및 granularity 증가와 같은 특징을 통해 대장암 세포의 senescence를 유도하였다. 염증성 사이토카인과 케모카인같은 SASP 관련 유전자의 발현이 억제 되었으며, MHC class I 발현은 증가한 반면 PD-L1은 전사 및 단백질 수준에서 상이한 조절 양상을 보였다. 더 나아가, scleroderolide 처리에 따라 autophagy 관련 유전자의 발현이 감소하여, senescence의 비가역적 유지와의 연관 가능성을 시사하였다. 종합적으로, 본 연구는 Penicillium sp. EML-48 유래 scleroderolide가 ROS 축적과 p53 활성화를 매개로 S기 세포주기 정지 및 senescence를 유도함으로써 대장암 세포 증식을 억제하는 비세포독성 항암 활성을 나타냄을 규명하였다. 이러한 결과는 scleroderolide가 세포주기 조절과 senescence 유도를 표적으로 하는 새로운 항암 후보 물질로서 활용될 수 있는 가능성을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 10
• 1. Cell culture 10
• 2. Cell proliferation assay 10
• 3. Trypan blue exclusion assay 10
• 4. Cell cycle analysis 11
• 5. Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (Real-Time RT-qPCR) 11
• 6. Western blot 14
• 7. Measurement of cellular ROS (reactive oxidative species) 14
• 8. Apoptosis assay 15
• 9. Flow cytometry analysis 15
• 10. SA-β-gal (senescence-associated beta-galactosidase) staining 15
• 11. DAPI (4’6-diamidino-2-phenylindole) staining 16
• 12. Statistical analysis 16
• Ⅲ. 결과 17
• 1. Penicillium sp. EML-48로부터 유래한 단일 화합물의 세포 처리 농도 결정 및 대장암 세포 증식 억제 효능을 갖는 단일 화합물 발굴 17
• 2. Scleroderolide에 의한 대장암 세포의 세포주기 억제 21
• 3. Scleroderolide에 의한 세포 내 ROS 증가 28
• 4. Scleroderolide에 의한 대장암 세포의 Apoptosis 유도 부재 30
• 5. Scleroderolide에 의한 대장암 세포의 Senescence 유도 32
• 6. Scleroderolide에 의해 유도된 senescent 대장암 세포의 면역반응 조절 35
• 7. Scleroderolide에 의한 대장암 세포의 Autophagy 억제 39
• Ⅳ. 고찰 41
• Ⅴ. 참고문헌 44
• Abstract (영문 초록) 49