Phytochrome-mediated blue light signaling and molecular functional studies on truncated CSA1 and BIC genes in plant responses to light and high-temperature = 파이토크롬에 의한 청색광 신호전달 및 식물의 빛과 고온 반응에서 절단된 CSA1 및 BIC 유전자의 분자 기능 연구

국문 초록 (Abstract)

파이토크롬은 적색광과 원적색광을 감지하는 광수용체로 잘 알려져 있다. 기존 연구에서 파이토크롬 결핍 식물체의 청색광 반응성이 야생형 식물보다 감소됨을 보여, 파이토크롬이 청색광 신호전달에도 관여함이 제시되었다. 하지만 파이토크롬에 의한 청색광 신호전달의 분자적 기전은 명확히 규명되지 않았다. 본 연구 첫번째 주제의 핵심 발견은 파이토크롬 상호작용인자 3(PIF3)의 청색광에 의한 분해가 청색광 수용체인 크립토크롬이 아니라 적색/원적색 광수용체인 파이토크롬A(phyA)와 파이토크롬B(phyB)에 의존한다는 것이었으며, 이는 청색광 조건에서 phyA 및 phyAphyB 돌연변이에서의 하배축 신장 표현형에 의해 검증되었다. 추가 분석을 통해, 청색광이 phyA와 phyB 광수용체를 활성화시킬 수 있고, 이는 이들의 핵으로의 이동과 PIF3상호작용을 유도하여 PIF3 단백질을 분해 시킨다는 것을 증명하였다. 저강도 청색광에서는 phyA가 주도적으로 PIF3 분해를 유도하였다. 또한 크립토크롬과의 협력하여 phyA와 phyB는 E3 ligase인 COP1/SPA 복합체의 불활성화를 통해 HY5 축적을 촉진하는 것으로 확인되었다. 그에 반해, 고강도 청색광에서는 phyB의 의한 PIF3 분해와 크립토크롬에 의한 HY5 축적이 뚜렷하게 나타났는데, 이는 광범위한 광 강도 범위에서 이러한 광 수용체 간의 상호 보완적이지만 중복되지 않는 방식으로 기능함을 보여준다. 게다가, 성체 식물의 잎에서는 청색광 감소가 노화 신호로 작용하는데, 이때 phyA는 PIF3 축적을 제한함으로써 SAG12 발현을 억제하며 CAB 전사체를 유지함으로써 엽록소 분해를 지연시켰다. 종합적으로, 본 연구의 결과는 phyA와 phyB가 청색광 하에서 크립토크롬과 상호 협력하여 PIF 분해와 HY5 축적을 조절하며, 이러한 파이토크롬의 청색광 신호전달에서의 조절 기능이 유식물체의 광형태형성에서부터 성체 식물의 잎 노화에 이르기까지 다양한 청색광 강도에서 폭넓게 작동함을 제시한다. CONSTITUTIVE SHADE-AVOIDANCE 1 (CSA1)는 TIR-NBS-LRR 타입의 면역 수용체를 암호화하는 유전자이다. T-DNA 삽입에 의해 생성된 csa1 돌연변이는 N-말단 TIR 도메인만을 포함하는 절단형 단백질(ΔCSA1)을 생산하며, 이를 통해 phyB 돌연변이와 유사한 하배축 신장과 장일 조건에서의 조기 개화 표현형을 나타낸다. 하지만 어떻게 ΔCSA1가 phyB 돌연변이와 유사한 표현형을 나타내는지에 대한 분자적 신호전달 기전은 규명되지 않았다. 본 연구의 두 번째 주제에서는 ΔCSA1이 파이토크롬 신호전달에서 핵심적인 역할을 하는 PIFs 단백질과 직접적으로 상호작용함을 밝혔다. 특히, ΔCSA1은 여러 PIF 가운데 광형태형성 과정에서 빛에 의해 인산화 되고 분해되는 PIF4와 가장 강하게 결합하였다. 비록 ΔCSA1이 phyB-PIF4 상호작용을 방해하지는 않지만, phyB 매개 PIF4 인산화를 억제함으로써 적색광 조건에서 유도되는 PIF4의 단백질 분해를 차단하였다. 이로 인해 ΔCSA1을 발현하는 식물에서는 적색광 하에서 PIF4 단백질 안정성이 증가하였고, 이는 YUC8, IAA19와 같은 PIF4 표적 유전자의 발현 증가로 이어져 하배축 신장과 조기 개화 등과 같은 음지회피성 반응에 해당하는 표현형이 나타났다. 또한, 광의존성 없이 핵에 축적되어 PIF 분해와 HY5 축적을 유도하는 항시활성 phyB 돌연변이(YVB)가 발현되는 식물에서도 ΔCSA1 발현을 통해 YVB에 의해 나타내는 constitutive photomorphogenic 표현형을 억제하였다. 또한, csa1 돌연변이나 ΔCSA1발현 식물의 하배축은 대조구 식물 (Col-0 및 Ler) 보다 현저하게 길었지만, phyB 돌연변이보다는 짧은 하배축을 보였는데, 이는 적색광 조건에서의 HY5 축적에 기인하는 것으로 여겨진다. 따라서 본 연구는 ΔCSA1이 TIR 도메인을 기반으로 PIF4와 상호작용하여 그 안정성을 높임으로써 phyB 신호전달을 억제하는 새로운 분자적 기전을 제시한다. 이러한 결과는 광에 의한 PIF4 분해와 HY5 축적 조절이 유식물체의 성공적인 광형태형성에 필수적임을 제시한다. BIC1및 BIC2 유전자는 청색광 조건에서 크립토크롬 활성을 억제하는 음성 조절자로 알려져 있으며, 기존 연구에서 PIF4와의 상호작용을 통해 BIC1이 전사 활성인자 역할 수행이 보고되기도 하였다. 이러한 연구들은 BIC들이 광수용체 억제 기능과 전사 조절이라는 두 가지 기능을 동시에 가진다는 점을 시사하고 있다. 또한 BIC 인자들의 서로 다른 세포내 위치가 보고되기도 하였다. 하지만 이들의 세포내 위치와 기능 간의 연관성은 연구되지 않았다. 본 연구의 세 번째 주제는 BIC1과 BIC2가 보이는 세포내 위치의 차이와 이들의 세포내 위치와 연관된 크림토크롬 억제 및 PIF4 조절에 대한 연관성을 규명하는 것이다. BIC1은 세포질과 핵에 모두 존재하였고, BIC2는 주로 핵에 위치해 있었다. 청색광 하에서, 핵 국소화 신호(NLS)를 결합하여 핵 내에 국한시킨 BIC1:NLS 및 BIC2:NLS 식물에서는 BIC1 및 BIC2 과발현 식물체가 광반응성이 유사한 수준으로 감소하였으며, 이는 핵 내에서 CRY 억제 기능이 유지됨을 보여준다. 반면, 핵 수출 신호 (NES) 결합으로 세포질에 존재하는 BIC1과 BIC2는 크립토크롬의 핵 내 이동을 보다 효율적으로 차단하였다. 또한, BIC들은 청색광 신호전달 조절뿐만 아니라 온도 반응성 생장에도 관여하였다. CRY1은 PIF4와 상호작용하여 그 전사 활성을 억제함으로써 고온반응성 생장을 제한하는데, BIC1과 BIC2는 CRY1-PIF4 상호작용을 방해하여 고온에서 하배축 신장을 촉진하였다. 반대로 BIC2가 핵에 과도하게 축적되는 BIC2:NLS 식물에서는 PIF4와의 상호작용을 증가시켜 PIF4 표적 유전자 발현이 억제되고, 그 결과 고온에서 하배축 신장이 감소하였다. 종합하면, 본 연구는 BIC1과 BIC2의 서로 다른 세포내 위치가 CRY 억제 기능과 PIF4 조절 기능을 분리하는 요소로 작용할 수 있음을 제시한다. 이러한 결과는 BIC들이 크립토크롬 신호전달과 PIF4 매개 전사 활성 간의 균형을 조절하여 광과 온도 신호에 대한 식물의 생장 반응을 정밀하게 조절하는 중요한 조절자로 기능함을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Phytochromes are well-characterized photoreceptors sensing red and far-red light. Previously, reduced responses to blue light of the phytochrome-deficient mutants were shown compared with wild-type Arabidopsis, suggesting that phytochromes also play roles in blue light signaling. However, the molecular mechanism underlying phytochrome-mediated blue light signaling remains largely unknown. In the first topic of this study, a key finding is that blue light-induced degradation of PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 3 (PIF3) depends on red/far-red photoreceptor phytochromes A and B (phyA and phyB), but not on blue photoreceptor cryptochromes, as evidenced by the phenotypes of exaggerated hypocotyl elongation in phyA and phyAphyB mutants under blue light. Subsequent analyses demonstrated that blue light is able to activate phyA and phyB, which induces their nuclear localization and interaction with PIF3, resulting in PIF3 degradation. Under low-intensity blue light, phyA predominantly mediates PIF3 degradation. In addition, likely in cooperation with cryptochromes, phyA also promotes HY5 accumulation through inactivation of the COP1/SPA E3 ligase complex. On the other hand, under high-intensity blue light, the functional role of phyB in PIF3 degradation and cryptochrome- mediated HY5 accumulation becomes more prominent, revealing a complementary but non- redundant functional relationship among these photoreceptors across a broad range of light intensities. Moreover, the reduction in blue light serves as a signal to trigger senescence in mature leaves, in which phyA delays chlorophyll degradation by limiting PIF3 accumulation, resulting in the transcriptional suppression of SAG12 but the maintenance of CAB transcript levels. Collectively, these findings indicate that phyA and phyB regulate PIF3 degradation and HY5 accumulation under blue light in coordination with cryptochromes, thereby extending their regulatory roles in blue light signaling from seedling photomorphogenesis to leaf senescence across various blue light intensities. CONSTITUTIVE SHADE-AVOIDANCE 1 (CSA1) encodes a Toll/Interleukin-1 receptor- nucleotide binding site-leucine-rich repeat (TIR-NBS-LRR) immune receptor. The csa1 mutant, generated by a T-DNA insertion, produces a truncated form (ΔCSA1) that leads to phenotypes similar to those of the phyB-deficient mutant, including elongated hypocotyls and early flowering under long-day conditions. However, the molecular signaling mechanism through which ΔCSA1 induces phyB-like phenotypes remains elusive. In the second topic of this study, a key finding is the direct interaction between ΔCSA1 and PIFs, which play critical roles in phytochrome signaling. In particular, among PIFs, ΔCSA1 interacted most strongly with PIF4, which is normally phosphorylated and degraded upon light exposure during photomorphogenic development. Although ΔCSA1 does not disrupt the interaction between phyB and PIF4, it inhibits phyB-mediated phosphorylation of PIF4 in vitro, which prevents red light-induced degradation in plants. Consequently, the expression of ΔCSA1 in plants elevates the levels of PIF4 under red light, thereby enhancing the transcription of PIF4-responsive genes such as YUC8 and IAA19, which can induce constitutive shade-avoidance phenotypes, including elongated hypocotyls and early flowering. Furthermore, in transgenic plants harboring a constitutively active phyB mutant (YVB), ΔCSA1 expression suppresses the light-independent constitutive photomorphogenic phenotype of the YVB plant. Additionally, the hypocotyl lengths of csa1 and ΔCSA1-expressing plants are significantly longer than those of the control plants (Col-0 and Ler), but shorter than those of the phyB-deficient mutants, due to HY5 accumulation under red light. These findings reveal a novel molecular mechanism in which the TIR-containing truncated form of CSA1 regulates phyB signaling by interacting with and stabilizing PIF4 in plants, and suggest that light-induced regulation of both PIF4 degradation and HY5 accumulation is important for the successful establishment of seedlings. BLUE LIGHT INHIBITORS OF CRYPTOCHROMES 1 and 2 (BIC1 and BIC2) are known as negative regulators of blue light signaling that suppress the activation of cryptochromes 1 and 2 (CRY1 and CRY2), and previous studies have also reported that BIC1 functions as a transcriptional coactivator through its interaction with PIF4. In addition, different subcellular localizations of BICs have been reported. However, the interconnection between their function and subcellular localization has not been studied. In the third topic of this study, key findings include distinct subcellular distribution patterns of BICs and the association of their differential localization with roles in cryptochrome inhibition and PIF4 regulation. BIC1 was localized to both the cytoplasm and the nucleus, whereas BIC2 was predominantly confined to the nucleus. Under blue light, BIC1:NLS and BIC2:NLS plants exhibited reduced responsiveness similar to BIC1- and BIC2-overexpressing plants, indicating that cryptochrome repression persists when BICs are restricted to the nucleus. In contrast, BIC1:NES and BIC2:NES plants, in which BICs accumulate in the cytoplasm, inhibit the nuclear import of CRYs. In addition to their roles in blue light signaling, BICs also function in temperature-responsive growth. CRY1 suppresses thermomorphogenesis by interacting with PIF4 and reducing its transcriptional activity, whereas BIC1 and BIC2 promote hypocotyl elongation at high-temperature by disrupting the CRY1-PIF4 interaction. Conversely, excessive nuclear accumulation of BIC2 in BIC2:NLS plants enhanced its association with PIF4, leading to repression of PIF4 target gene expression and consequently reducing hypocotyl elongation under high-temperature. Collectively, these results suggest that the distinct subcellular localizations of BIC1 and BIC2 contribute to the functional separation of cryptochrome inhibition and PIF4 regulation. Therefore, BICs may act as integrative regulators for growth responses to light and temperature signals under variable environmental conditions by modulating the balance between cryptochrome signaling and PIF4-mediated transcriptional activity.

목차 (Table of Contents)

• (Abstract) 1
• Chapter 1. Phytochromes function in blue light signaling to regulate plant
• photomorphogenesis 5
• 1.1. Introduction 5
• 1.2. Materials and Methods 8
• 1.2.1. Plant materials 8
• 1.2.2. Photoresponse analysis of seedlings 8
• 1.2.3. Detection of PIFs and HY5 in plants 9
• 1.2.4. Preparations of recombinant proteins 9
• 1.2.5. Spectroscopic analysis 10
• 1.2.6. Confocal microscopy analysis 10
• 1.2.7. In vitro protein-protein interaction assays 10
• 1.2.8. Phytochrome degradation and nuclear-cytoplasmic fractionation analysis 11
• 1.2.9. Yeast three-hybrid (Y3H) assay 11
• 1.2.10. Leaf senescence assay 12
• 1.2.11. Gene expression analysis 12
• 1.2.12. Statistical analysis 13
• 1.3. Results 15
• 1.3.1. Phytochromes A and B inhibit hypocotyl elongation under blue light by promoting
• PIF degradation 15
• 1.3.2. Blue light is able to activates phyA and phyB, which induces nuclear translocation
• and interaction with PIF3 19
• 1.3.3. Phytochromes A and B act cooperatively in blue light signaling depending on light
• intensity, which requires kinase activity for PIF3 regulation 23
• 1.3.4. Phytochromes and cryptochromes cooperatively regulate photomorphogenesis
• under varying blue light intensities 29
• 1.3.5. phyA delays leaf senescence under low blue light by regulating PIF3 stability 34
• 1.4. Discussion 37
• 1.5. References 42
• Chapter 2. A truncated form of CSA1 suppresses phyB signaling by stabilizing PIF4 in
• Arabidopsis 45
• 2.1. Introduction 45
• 2.2. Materials and Methods 48
• 2.2.1. Plant materials 48
• 2.2.2. Photoresponse analysis of seedlings 49
• 2.2.3. Phenotypic analysis 49
• 2.2.4. Confocal microscopy analysis 49
• 2.2.5. Preparation of recombinant proteins 50
• 2.2.6. In vitro protein-protein interaction assay 51
• 2.2.7. Luciferase complementation imaging (LCI) assay 51
• 2.2.8. Yeast two-hybrid (Y2H) assay 52
• 2.2.9. In vitro kinase assay 52
• 2.2.10. Detection of PIFs and HY5 levels in plants 53
• 2.2.11. Gene expression analysis 53
• 2.2.12. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 54
• 2.2.13. Statistical analysis 54
• 2.3. Results 58
• 2.3.1. A truncated form of CSA1 suppresses phyB-mediated responses to light in plants 58
• 2.3.2. ΔCSA1 interacts with PIFs selectively 64
• 2.3.3. ΔCSA1 inhibits phyB-induced phosphorylation of PIF4, increasing its protein
• stability 72
• 2.3.4. Suppression of the constitutively active phyB signaling by ΔCSA1 83
• 2.3.5. Phenotypes of plants expressing ΔCSA1 86
• 2.4. Discussion 90
• 2.5. References 95
• Chapter 3. Subcellular localization of BIC1 and BIC2 regulates plant responses to light and
• high-temperature 98
• 3.1. Introduction 98
• 3.2. Materials and Methods 101
• 3.2.1. Plant materials 101
• 3.2.2. Photoresponse analysis of seedlings 102
• 3.2.3. Confocal microscopy analysis 102
• 3.2.4. Nuclear and cytoplasmic fractionation analysis 102
• 3.2.5. Measurement of flowering time 103
• 3.2.6. Agrobacterium-mediated transient expression in Nicotiana benthamiana 103
• 3.2.7. Gene expression analysis 103
• 3.2.8. Temperature treatment and thermoresponsive growth analysis 104
• 3.2.9. Detection of PIF4 levels in plants 104
• 3.2.10. Luciferase complementation imaging (LCI) assay 104
• 3.2.11. In vitro protein-protein interaction assay 105
• 3.2.12. Co-immunoprecipitation (Co-IP) assay 105
• 3.2.13. Dual-luciferase reporter (DLR) assay 106
• 3.2.14. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 106
• 3.2.15. Statistical analysis 107
• 3.3. Results 111
• 3.3.1. Distinct subcellular localization of BIC1 and BIC2 111
• 3.3.2. Cytoplasmic BICs suppress blue light responses by limiting cryptochrome nuclear
• import 119
• 3.3.3. BICs influence thermoresponsive growth by modulating interaction between CRY1
• and PIF4 126
• 3.3.4. Nuclear-localized BIC2 suppresses thermoresponsive growth without altering PIF4
• protein levels 130
• 3.3.5. BIC1 and BIC2 differentially modulate PIF4-dependent transcription in a
• subcellular localization-dependent manner 134
• 3.4. Discussion 139
• 3.5. References 145
• (국문초록) 148