Exploration of Novel Transcriptional Regulators for Seed Storage Proteins in Rice = 벼 종자 저장 단백질의 새로운 전사 조절인자 탐색

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In rice, seed storage proteins (SSPs)—mainly glutelins, prolamins, and globulins—are key determinants of seed development, quality, and nutritional value. Their synthesis and accumulation are primarily regulated at the transcriptional level. To identify novel transcriptional regulatory mechanisms, transcriptome-based correlation analysis was performed. Nine transcription factors (OsGATA8, OsMIF1, OsMIF2, OsGZF1, OsbZIP58, OsS1Fa1, OsS1Fa2, OsICE2, and OsMYB24) strongly co-expressed with glutelin and prolamin genes. Expression analyses revealed that these transcription factors are primarily expressed during seed development. Promoter analysis further showed that seed-specific and hormone-responsive cis-regulatory elements are highly enriched, suggesting their involvement in seed maturation and hormone signaling. Among them, OsMIF1 and OsMIF2, belonging to the Mini zinc finger (MIF) subgroup, were functionally characterized using CRISPR- Cas9 knockout lines. Mutants exhibited enlarged grains due to increased epidermal cell size, along with reduced panicle length and branching. RNA-seq analysis showed altered expression of genes involved in development, hormone signaling, and stress responses. In particular, genes related to grain size were markedly upregulated, supporting the relationship between seed size and genotype. Furthermore, Yeast Two-Hybrid library screening identified ten OsMIF1-interacting proteins involved in developmental, hormonal, stress- related, and metabolic pathways, among which three genes contained zinc finger domains. Together, these findings highlight OsMIF1 and OsMIF2 as integrative regulators linking developmental and adaptation pathways with the transcriptional network controlling SSPs, offering valuable molecular targets for improving rice seed quality and yield. Part I Transcriptome-Based Identification of Novel Transcription Factors Regulating Seed Storage Proteins in Rice

국문 초록 (Abstract)

벼에서 종자 저장 단백질(Seed Storage Proteins, SSPs)은 주로 글루텔린(glutelin), 프로라민(prolamin), 글로불린(globulin)으로 구성되며, 종자의 발달, 품질, 영양적 가치를 결정하는 핵심 요인으로 작용한다. SSP의 합성과 축적은 해당 유전자의 발현에 의해 조절되며, 이 과정은 주로 전사 수준에서 제어된다. 새로운 전사 조절 기작을 규명하기 위해 전사체 기반 상관분석을 수행한 결과, 주요 저장 단백질 유전자인 글루텔린과 프로라민과 강하게 공발현되는 아홉 개의 전사인자(OsGATA8, OsMIF1, OsMIF2, OsGZF1, OsbZIP58, OsS1Fa1, OsS1Fa2, OsICE2, OsMYB24)가 확인되었다. 발현 분석 결과, 이들 전사인자는 주로 종자 발달 과정에서 높은 수준으로 발현되었으며, 프로모터 분석을 통해 종자 특이적 및 호르몬 반응성 시스 조절 요소(cis-regulatory element)가 풍부하게 존재함이 확인되어, 종자 성숙과 호르몬 신호 조절에 관여함을 시사하였다. 이 중 Mini zinc finger(MIF) 아류군에 속하는 OsMIF1과 OsMIF2 전사인자는 생식 발달 단계에서의 기능이 밝혀지지 않은 유전자들로, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 돌연변이체를 통해 기능적 분석을 수행하였다. 그 결과, osmif1 및 osmif2 돌연변이체는 표피 세포 크기의 증가로 인해 종자가 비대해졌으며, 수상 길이와 분지수가 감소하는 표현형을 보였다. RNA-seq 분석에서는 OsMIF1과 OsMIF2의 결손이 발달 프로그램, 호르몬 신호전달, 스트레스 반응 관련 유전자의 발현을 변화시켰으며, 특히 종자 크기 관련 유전자들이 현저히 상향 조절되어 종자 크기와 유전자형 간의 연관성이 확인되었다. 또한 Yeast Two-Hybrid 라이브러리 스크리닝을 통해 OsMIF1이 발달, 호르몬, 스트레스, 대사 경로에 관여하는 10개의 단백질과 상호작용함이 확인되었으며, 이 중 3개의 유전자가 zinc finger 도메인을 포함하고 있었다. 이러한 결과는 OsMIF1과 OsMIF2가 매개하는 발달 및 환경 적응 기작이 종자 저장 단백질 전사 조절 네트워크와 통합적으로 연결되어 있음을 보여주며, 종자 품질과 수량 향상을 위한 유전공학적 개량에 유용한 분자적 표적을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract 1
• Part I Transcriptome-Based Identification of Novel Transcription Factors Regulating Seed Storage Proteins in Rice 3
• 1.1. Introduction 4
• 1.2. Materials and Methods 8
• 1.2.1. Correlation Analysis between Transcription Factors and Seed Storage Protein Genes Based on Rice Seed Transcriptome Data 8
• 1.2.2. Information on Selected Transcription Factors 9
• 1.2.3. Protein–Protein Interaction (PPI) Network Analysis 9
• 1.2.4. Rice Protoplast Transient Expression and qRT-PCR Analysis 9
• 1.2.5. RNA Extraction and Quantitative RT-PCR 13
• 1.2.6. GUS Staining Assay 15
• 1.2.7. Yeast Two-Hybrid Assay 17
• 1.2.8. Cis-Regulatory Element (CRE) Frequency Analysis 19
• 1.3. Results 20
• 1.3.1. Identification and Classification of Novel Transcription Factors Associated with Seed Storage Protein Genes 20
• 1.3.2. Analysis of Protein–Protein Interaction (PPI) Networks Predicted for Candidate Transcription Factors 26
• 1.3.3. Expression Profiles of Candidate TFs during Rice Seed Development 29
• 1.3.4. Genome-Wide Enrichment Analysis of Cis-Regulatory Elements 32
• 1.4. Discussion 36
• Part II Functional Characterization of Rice Zinc Finger Homeobox Transcription Factors OsMIF1 and OsMIF2 Reveals Their Regulatory Roles in Grain Size and Panicle Development 41
• 2.1. Introduction 42
• 2.2. Materials and Methods 45
• 2.2.1. Sequence Alignment and Prediction of Protein Structure 45
• 2.2.2. RNA Isolation and Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) 48
• 2.2.3. GUS Staining Assay 52
• 2.2.4. Hormone Treatment 52
• 2.2.5. Prediction of Cis-acting Regulatory Elements 53
• 2.2.6. Generation of OsMIF1 and OsMIF2 Knockout Rice 53
• 2.2.7. Verification of Mutations in CRISPR-Cas9 Edited Lines 54
• 2.2.8. Scanning Electron Microscopy (SEM) Observation 56
• 2.2.9. Transcriptome Analysis 56
• 2.2.10. Y2H Library-scale Screening Assay 57
• 2.3. Results 60
• 2.3.1. Structural and Evolutionary Features of OsMIF1 and OsMIF2 within the ZF-HD Transcription Factor Family 60
• 2.3.2. Expression Profiling of OsMIF1 and OsMIF2 During Rice Development and Hormonal Responses 67
• 2.3.3. Phenotypic Characterization of OsMIF1 and OsMIF2 Mutants 74
• 2.3.4. Global Gene Expression Profiling of the OsMIF1 and OsMIF2 Mutants 85
• 2.3.5. Functional Roles of OsMIF1 and OsMIF2 in Seed Development 97
• 2.3.6. Identification of OsMIF1-Interacting Proteins by Yeast Two-Hybrid Screening 103
• 2.3.7. Root Development and Salt Stress Sensitivity of OsMIF1 and OsMIF2 Mutants 112
• 2.4. Discussion 115
• References 121
• Abstract in Korean 140