Comparative analysis of multiple Mg2+-binding states in two class II pyruvate aldolases = 유형2 피루베이트 알돌레이즈에서 마그네슘 이온의 다중 결합 상태에 대한 비교 분석 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Metal ions are indispensable for the function of metalloproteins. Interestingly, recent structural studies have revealed that catalytic metal ions can undergo small but distinct positional shifts within protein interiors. However, the functional relevance of this motion and the structural factors that drive it remain unclear. To address these questions, two class II pyruvate aldolases have been analyzed to compare their metal-binding environments and elucidate the origin of metal repositioning. High-resolution structures of aldolases from Achromobacter xylosoxidans (AxADL) and Pseudomonas aeruginosa (PaADL) have been determined in apo, Mg²⁺-bound, and Mg²⁺/pyruvate-bound states. Both enzymes exhibit a common pattern in which the metal ion shifts toward the catalytic center upon substrate binding, accompanied by subtle geometric adjustments of the surrounding residues. In particular, a methionine residue positioned adjacent to the metal-binding site exerts a steric influence that promotes this metal displacement, and this repositioning correlate with an increase in catalytic activity. These findings indicate that metal movement in class II pyruvate aldolases is modulated not only by changes in coordination geometry but also by local steric constraints imposed by neighboring residues. The results provide structural evidence that such residue-level interactions can fine-tune metal positioning and contribute to the catalytic mechanism of these enzymes.

국문 초록 (Abstract)

금속 이온은 금속효소의 구조적 안정성과 촉매 기능에 필수적이며, 최근 구조
연구들은 촉매 금속 이온이 단백질 내부에서 작지만 뚜렷한 위치 이동을 일으킬 수
있음을 보여주고 있다. 그러나 이러한 이동이 갖는 기능적 의미와 이를 유발하는
구조적 요인은 아직 명확히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 금속 이동의 기원과
조절 원리를 밝히기 위해 두 종류의 class II pyruvate aldolase를 대상으로 금속
결합 환경을 비교 분석하였다. Achromobacter xylosoxidans(AxADL)와
Pseudomonas aeruginosa(PaADL)의 apo, Mg²⁺-결합, 그리고 Mg²⁺/pyruvate-결
합 상태 구조를 고해상도로 규명한 결과, 두 효소 모두에서 기질 결합 시 금속 이
온이 촉매 중심을 향해 이동하는 공통된 양상이 관찰되었으며, 이는 주변 배위 잔
기들의 미세한 기하학적 변화와 함께 나타났다. 특히 금속 결합 부위 인근의 메티
오닌 잔기가 입체적 제약을 제공하여 금속 위치 변화를 유도하는 것으로 보였으며, 이러한 금속 위치 변화는 효소에서의 촉매 활성 증가와도 연관성을 보였다. 본 연
구는 class II pyruvate aldolase에서 금속 이온의 위치가 단순한 배위 변화뿐 아
니라 주변 잔기들이 형성하는 국소적 입체 환경에 의해 정교하게 조절됨을 구조적
으로 제시하며, 이러한 조절 메커니즘이 효소의 촉매 기능에 중요한 역할을 한다는
근거를 제공한다

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT 1
• Ⅰ. INTRODUCTION 3
• Ⅱ. PRINCIPLES 7
• 1. Principles of protein purification 7
• 1.1 Affinity chromatography 7
• 1.2 Ion exchange chromatography 8
• 2. Protein crystallization 10
• 3. X-ray crystallography 12
• 4. Site-directed mutagenesis 14
• Ⅲ. MATERIALS AND METHODS 15
• 1. Cloning of DrADL ,PaADL, and AxADL 15
• 2. Site-directed mutagenesis of ADL proteins 16
• 3. Expression and purification of ADL proteins 17
• 3.1 expression of in E. coli 17
• 3.2 Ni ion affinity chromatography 17
• 3.3 Ion exchange chromatography 19
• 4. Crystallization of ADL proteins and their mutants 22
• 5. X-ray diffraction data collection 24
• 6. Enzymatic assays for pyruvate-formaldehyde conversion 26
• Ⅳ. RESULTS
• 1. Overall structural features of DrADL, PaADL, and AxADL 28
• 2. Active site structures of apo and mg-bound ADLs 31
• 3. Active site structures of Mg²⁺/pyruvate- and Mg²⁺
• /pyruvate/formaldehyde-bound forms 33
• 4. Enzymatic activity for ADLs and their mutants in pyruvate–
• formaldehyde conversion 34
• Ⅴ. DISCUSSION 36
• Ⅵ. REFERENCES 40
• ABSTRACT IN KOREAN 43