Acidithiobacillus ferrooxidans의 세포 포획 고정화 및 고정화세포 연속배양 공정 개발 = Development of cell capture immobilization and cell continuous culture process of Acidithiobacillus ferrooxidans

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 Acidithiobacillus ferrooxidans 미생물을 PVA-alginate matrix에 고정화한 후, 고 정화 세포에 의한 철 산화를 위한 연속배양 특성을 고찰하였다. 먼저 효율적인 세포 포획 (cell entrapment)에 의한 고정화 세포 준비를 위해, cell stock 내 세포 농도(OD600: 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0), 고정화 비드 직경(3.0mm, 3.5mm, 4.0mm), 비드 농도(immobilized-cell bead: 5%, 10%, 15%, 20% w/v)를 변수로 설정하여 세포 고정화 및 고정화 세포에 의한 플라스크 배양 실험을 수행하였다. 그 결과, OD600 = 2.0인 cell stock을 이용하여 3.5mm 직경의 PVA-alginate bead에 cell entrapment 고정화를 10%(w/v)로 수행했을 시, Fe2+ 산화 속도가 0.07g/L/h로 가장 우수함 이 확인되었다. 추가적으로 고정화세포 농도의 경우, 10% 농도 조건이 Fe2+ 산화속도 증진에 가장 적합함이 확인되었다. 이상의 최적 조건의 고정화세포를 이용하여 플라스크 수준에서 반복회분식 배양을 수행하여 회분식 배양이 반복됨에 따른 Fe2+ 산화속도의 변화를 관찰하였 다. 그 결과, 회분식 배양이 3번까지 반복됨에 따라 Fe2+ 산화 속도가 급격히 증가하여 0.22g/L/h까지 증가하였고, 그 후 감소하여 4번째 회분식 배양부터 15번째 회분식 배양가지는 Fe2+ 산화속도가 일정한 범위 (0.14 ~ 0.17 g/L/h)에서 유지됨이 관찰되었다. 반복회분식 배양 초기에는 고정화 세포의 농도가 증가함에 따라 Fe2+ 산화속도가 증가한 것으로 판단되었고, 이후에는 고정화 세포의 농도가 정상상태에서 유지되었기 때문에 Fe2+ 산화 속도가 일정하게 유지된 것으로 판단되었다. 이로부터 본 연구에서 구축된 고정화 세포 시스템이 장기적으로 반복 사용이 가능함이 입증되었고, 따라서 장기 연속배양 공정 개발에 적합한 것으로 판단되 었다. 개발된 고정화 세포를 이용하여 dilution rate을 0.1 ~ 0.4h-1로 변화시켜 가면서 장기연속 배양 을 수행하였다. 희석속도 0.1h-1에서는 거의 모든 Fe2+ 이온이 산화된 것이 확인되었다. 이는 희석속도가 낮아 배양액의 머무름 시간이 길고, 또한 생성된 free cell에 의한 철 산화도 진행 되었기 때문인 것으로 판단된다. A. ferrooxidans의 경우 최대 비성장 속도 (mmax) 가 0.07h-1인 것으로 알려져 있다. 반면 희석속도를 0.2h-1로 높인 경우, 배양액 내 Fe2+ 농도가 0.5g/L로 상 대적으로 높게 관측되었다. 이는 배양액 내 free cell이 전혀 존재하지 않는 환경에서 오로지 고정화세포에 의해서만 철 산화가 이루어지고, 또한 희석속도 증가에 따른 Fe2+의 반응기 내 체류 시간이 짧아졌기 때문으로 판단된다. 희석속도를 0.3h-1및 0.4h-1로 더욱 더 증가시킴에 따라 배양액 내 Fe2+ 농도가 급격히 증가하여 1.4g/L 및 3.6g/L 가 관측되었다. 이는 희석속도 증가에 따라 기질 농도가 증가하는 전형적인 케모스탯 (chemo-stat) 특성을 보여준다. 희석속 도에 따른 연속배양의 kinetics 분석한 결과, 희석속도 0.3h-1 조건에서 최대 Fe2+ 산화속도인 2.3g/L/h 및 최대 Fe3+ 생성속도인 1.7g/L/h가 관측되었다. 최대 Fe2+ 산화속도와 최대 Fe3+ 생 성속도가 다른 이유는 생성된 Fe3+의 일부가 불용성 침전물 (jarosite)로 전환되었기 때문인 것 으로 판단된다. 따라서 본 고정화 세포 연속배양 시스템의 경우, 희석속도 0.3h-1 조건이 Fe2+ 산화 및 수용성 Fe3+ 생성에 최적인 것으로 분석된다. 본 연구에서는 A. ferrooxidans 고정화세포 연속배양 시스템의 Fe2+ 산화 및 Fe3+ 생성을 위 한 최적 운전 조건을 체계적으로 규명하였다. 또한 장기간 안정적인 연속조업의 가능성이 입 증되었다. 따라서 본 시스템은 광산배수 처리(AMD), 황화수소제거, 금속 용출 등 다양한 환 경정화 및 자원순환 산업에 응용될 수 있는 가능성을 보여준다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In this study, the continuous culture characteristics for iron oxidation by Acidithiobacillus ferrooxidans immobilized within a PVA–alginate matrix were investigated. To prepare immobilized cells through efficient cell entrapment, three key variables—cell concentration in the cell stock (OD600: 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0), bead diameter (3.0, 3.5, and 4.0mm), and bead concentration (5%, 10%, 15%, and 20% w/v)—were systematically varied in flask culture experiments. As a result, the highest Fe 2+ oxidation rate was obtained when beads with a diameter of 3.5mm were prepared using a cell stock of OD600 = 2.0. Furthermore, a bead concentration of 10%(w/v) was found to be the most suitable condition for enhancing the Fe
2+ oxidation rate. Repeated-batch culture experiments were then conducted under these optimized immobilization conditions to observe changes in Fe 2+ oxidation activity over successive batches. The Fe 2+ oxidation rate increased sharply up to 0.22g/L/h by the third cycle and then stabilized, maintaining a steady range of 0.14–0.17g/L/h from the fourth to the fifteenth cycle. The initial enhancement of Fe 2+ oxidation was attributed to the increased biomass of the immobilized cells, while the subsequent stable reaction rate indicated that the immobilized cell concentration had reached a steady-state equilibrium. These results demonstrate that the developed immobilized-cell system can be reused over extended periods and is thus suitable for long-term continuous operation. Continuous culture experiments were performed at dilution rates ranging from 0.1 to 0.4h -1 to further evaluate the performance of the immobilized-cell system. At a dilution rate of 0.1 h -1 , almost all Fe 2+ ions were oxidized, likely due to the long residence time and additional oxidation by free cells released from the beads. Given that the maximum specific growth rate (μmax) of A. ferrooxidans is known to be 0.07h -1, increasing the dilution rate to 0.2h-1 resulted in a higher residual Fe 2+ concentration (0.45g/L), indicating that iron oxidation occurred solely by immobilized cells under cell-free conditions with reduced residence time. Further increases in the dilution rate to 0.3 and 0.4h -1 led to a sharp rise in Fe 2+ concentration to 1.44 and 3.61g/L, respectively, exhibiting a typical chemostat behavior with increasing substrate concentration.
Kinetic analysis of continuous cultures revealed that Fe 2+ oxidation and Fe 3+ production reached their maximum rates of 2.27g/L/h and 1.75g/L/h, respectively, at a dilution rate of 0.3h
-1. The slightly lower Fe 3+ production rate compared to Fe 2+ oxidation was likely due to partial conversion of the produced Fe 3+ into insoluble precipitates such as jarosite. Therefore, the optimal operating condition for Fe 2+ oxidation and soluble Fe 3+ generation in this immobilized-cell continuous culture system was determined to be at a dilution rate of 0.3h -1.
In conclusion, this study systematically elucidated the optimal operating parameters for Fe 2+ oxidation and Fe 3+ production in an A. ferrooxidans immobilized-cell continuous culture system and confirmed the feasibility ofstable long-term operation. The developed system shows great potential for application in various environmental remediation and resource recovery processes, including acid mine drainage treatment, hydrogen sulfide removal, and metal bioleaching.

목차 (Table of Contents)

• 1. 서론 1
• 가. 연구 배경 1
• 나. 연구범위 및 목표 3
• 2. 이론적 배경 및 연구동향 4
• 가. 생물학적 Fe2+ 산화 4
• 나. 세포 고정화 및 PVA-alginate 비드 5
• 다. 에어리프트 반응기 기반 연속 배양 8
• 라. Fe3+-유도 침전 및 jarosite 형성 억제 9
• 마. 연속배양 및 공정 최적화 11
• 3. 실험 방법 12
• 가. 균주 및 배지 12
• 나. 세포 고정화 13
• 다. 플라스크 배양 16
• 라. 고정화세포 연속 배양 18
• 마. 분석 방법 20
• 4. 결과 및 고찰 21
• 가. 세포 고정화 21
• 나. 고정화세포 반복회분식 배양 29
• 다. 고정화세포 연속식 배양 31
• 5. 결론 35
• 6. 참고문헌 36
• Abstract(영문초록) 41