Systematic evaluation and machine learning-based prediction of IscB-ωRNA variant activities

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

An IscB protein derived from the human gut metagenome (OgeuIscB), a hyper-compact RNA-guided endonuclease encoded by IS200/IS605 transposons, is considered an evolutionary ancestor of Cas9. It consists of only ~500 amino acids, making it approximately three times smaller than SpCas9. Unlike Cas9, IscB lacks the REC domain and instead relies on an associated noncoding RNA known as OMEGA RNA (ωRNA) for target DNA recognition. The wild-type IscB system exhibits limited genome editing activity in human cells; therefore, several IscB and ωRNA variants have been developed through mutational scanning and rational design. In this study, we first evaluated the editing efficiencies of 30 combinations, comprising five IscB proteins and six ωRNA scaffolds, at 805 target sequences. Next, we thoroughly characterized the enIscB–ωRNA* system, which exhibited the highest editing efficiency among the 30 combinations, using a library comprising 23,195 ωRNA*–target sequence pairs. The resulting large-scale dataset enabled us to determine the target-adjacent motif (TAM) preference of enIscB and to profile on-target and off-target editing activities across a broad range of target sites. In addition, leveraging this dataset, we developed a deep learning model capable of predicting IscB activity and designing optimized ωRNA* sequences for given target sites. Altogether, this study provides a comprehensive framework for optimizing genome editing using a hyper-compact IscB system and offers valuable insights for its future application in therapeutic and precision genome engineering.

국문 초록 (Abstract)

IscB 단백질은 IS200/IS605 transposons에 의해 암호화되는 아주 작은 RNA-guided endonuclease이며, RuvC 및 HNH domain이 진화적으로 보존되어 Cas9의 진화적인 조상으로 여겨진다. human gut metagenome에서 발견된 IscB는 496aa로 이루어져 있어 1368aa로 이루어진 SpCas9에 비해 약 3배 작은 크기를 가지며, REC domain 이 없고 OMEGA RNA로 알려진 noncoding RNA를 통해 표적 DNA를 인식할 수 있다. IscB 의 작은 크기는 단일 AAV를 통해서 전달이 가능하다는 장점이 있으나, 자연형 IscB는 사람 세포에서 유전자 편집 활성이 낮다는 한계가 존재하여 이를 개선하고자 IscB 단백질 및 RNA scaffold 구조에 추가적인 개량을 통해 효율을 개선하고자 하는 연구가 다수 존재한다.
본 연구에서는 자연형을 포함하여 보고된 5가지의 IscB 단백질과 6가지의 ωRNA scaffold의 가능한 모든 조합인 30개의 쌍이 805개의 표적 서열에서 나타내는 유전자 교정 효율을 측정하였다. 이를 통해서 enIscB와 ωRNA*의 조합이 가장 효율이 좋았다는 것을 확인하였으며, ωRNA* scaffold의 경우 다른 IscB 변이와 조합했을 때도 전반적으로 높은 효율을 보이는 것을 확인하였다.
이어서, 우리는 가장 효율이 높았던 enIscB-ωRNA* system을 대상으로 하여 23,795개의 표적 서열 라이브러리를 활용하여 활성을 확인하였다. 이를 통해 IscB system의 TAM 서열 선호도 및 off-target 유전자 편집 활성, guide 서열 길이 선호도 등 enIscB-ωRNA* system의 특징을 분석하였다. 또한 high-throughput screening을 통해 얻은 대량 데이터를 바탕으로 하여 딥러닝 모델을 제작하였으며, 제작된 모델은 피어슨 연관계수가 0.79으로 실제 실험 결과와 비교했을 때 높은 연관성을 보이는 것을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• Chapter 2. Materials & Methods 3
• 1. Materials 3
• 2. Methods 5
• 1) Library design 5
• 2) Preparation of plasmid library 5
• 3) Preparation of IscB variants-encoding plasmids 5
• 4) Production of lentivirus 6
• 5) preparation of IscB variant-expressing cell lines 7
• 6) High-throughput evaluation 7
• 7) Deep sequencing 8
• 8) Analysis of indel frequencies 9
• 9) Development of DeepIscB 9
• Chapter 3. Result 11
• 1. Systematic activity comparison of IscB and ωRNA variants 11
• 2. TAM determination of IscB variants 16
• 3. Mismatch tolerance of IscB variants 23
• 4. Machine learning-based prediction of optimal IscB-ωRNA combinations 26
• 5. Optimal guide sequence length for IscB 31
• Chapter 4. Discussion 34
• References 36
• 논문요약 41