Optimized prime editing for the treatment of NMNAT1-associated leber congenital amaurosis

국문 초록 (Abstract)

유전성 망막이상증(Inherited retinal dystrophies, IRDs)의 원인유전자는 인종 간 상당한 유전적 이질성을 보이며, 이는 인구 집단 맞춤형 정밀 유전자 치료의 필요성을 시사한다. 중증 조기 발병 IRD인 레베르 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis, LCA)는 시각 장애 아동의 실명 원인 중 약 20%를 차지하는 주요 질환이다. 현재까지 보레티진 네파보벡(voretigene neparvovec, 제품명: Luxturna)이 LCA에 대해 유일하게 승인된 유전자 치료제이나, 그 표적인 RPE65 유전자 돌연변이는 동아시아 인구 집단에서는 드물게 나타난다. 반면, NMNAT1 c.709C>T (p.Arg237Cys) 변이는 동아시아에서 주요한 병원성 돌연변이로 보고되었으나, 이에 대한 치료제는 아직 개발되지 않아 미충족 의료 수요로 남아 있다. 본 연구에서는 최적화된 프라임 에디팅 시스템을 활용하여, NMNAT1 연관 레베르 선천성 흑암시를 치료하기 위한 단회 투여 기반의 유전체 교정 치료 전략을 제시한다. 총 19,195종으로 구성된 pegRNA 라이브러리에 대한 고처리량 스크리닝을 통해 해당 병원성 변이를 고효율로 교정할 수 있는 선도 pegRNA들을 발굴하였다. 이어지는 개별 검증과 pegRNA 및 프라임 에디터 단백질의 단계적인 최적화를 통해 편집 성능을 추가로 향상시켰으며, 그 결과 인간 세포주에서 최대 80%에 달하는 유전체 교정 효율을 달성하였다. 나아가 후속 중개 연구 모델 적용을 위해 최적화된 프라임 에디터가 세포 내에서 효율적으로 재조합될 수 있도록 이중 AAV 인테인 분할 전달 시스템을 구축하였다. 종합적으로 본 연구는 인구 집단 맞춤형 유전체 교정 치료를 위한 개념적 및 기술적 기반을 확립하였으며 유전 질환 치료의 임상적 적용으로의 확장 가능성을 제시한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Inherited retinal dystrophies (IRDs) exhibit significant genetic heterogeneity across ethnic populations, necessitating population-specific precision gene therapies. Leber congenital amaurosis (LCA), a severe early-onset IRD, accounts for approximately 20% of childhood blindness among children with visual impairment. While voretigene neparvovec (LUXTURNA) remains the only approved gene therapy for LCA, its target—RPE65 mutations—is rare in East Asian populations. Instead, the NMNAT1 c.709C>T (p.Arg237Cys) variant represents a major pathogenic hotspot mutation in East Asia, constituting a substantial unmet clinical need. Here we report a permanent, one-shot therapeutic strategy for NMNAT1-associated LCA using an optimized prime editing system. By performing high-throughput screening of a 19,195-member pegRNA library, we identified lead candidates enabling highly efficient correction of the pathogenic variant. Subsequent validation and optimization of pegRNA and prime editor protein further enhanced prime editing performance, achieving up to 80% genome correction in human cell lines. Furthermore, we established a dual-AAV intein-split delivery system to enable efficient in vivo reconstitution of the optimized prime editor for downstream translational models. Collectively, this study establishes a generalizable framework for population-tailored genome editing therapies, providing a clinically translatable path for treating inherited disorders.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• Chapter 2. Materials and Methods 4
• 1. Mammalian cell line culture and selection conditions 4
• 2. Lentivirus production 4
• 3. Generation of PE-expressing and target-harboring cell lines 5
• 4. High-throughput pegRNA library screening and deep sequencing 6
• 5. Deep sequencing data analysis 7
• 6. Transfection-based editing analysis 8
• Chapter 3. Results 9
• 1. High-throughput screening identifies lead pegRNAs for correction of the NMNAT1 c.709C>T mutation 9
• 2. Lead pegRNAs achieve efficient correction of endogenous NMNAT1 in human cell lines 14
• 3. Silent mutation enhances prime editing efficiency in an MMR-proficient cells 17
• 4. Prime editor engineering further elevates genome correction efficiency 21
• Chapter 4. Discussion 25
• References 27
• 논문요약 31