Isopropylphenidate induces addictivelike behaviors via modulation of D1 receptor signaling pathway

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Isopropylphenidate (IPH) is a central nervous system (CNS) stimulant and a structural analogue of methylphenidate (MPH), widely used for attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) treatment. Psychostimulants are well known to exhibit addictive-like properties primarily through dopaminergic system. IPH has recently been regulated as a controlled substance due to its pharmacological similarity to methamphetamine (METH) and several side effects. However, the addictive properties of IPH and its underlying mechanism in the dopaminergic system have not been fully understood. In this study, I evaluated the abuse potential of IPH using the conditioned place preference (CPP) and behavioral sensitization (BS) paradigms in mice. To further investigate the involvement of dopaminergic signaling, I administered dopamine receptor antagonists during the CPP and BS, and selectively inhibited dopamine D1 receptors (D1DR)-expressing medium spiny neurons (MSNs) in the nucleus accumbens (NAc) via chemogenetic approach in separate cohorts in the CPP. Moreover, I measured dopamine concentration and the expression levels of dopamine-related proteins in the NAc and the VTA using molecular experiments such as enzyme-linked immunosorbent assay, Western blot and immunofluorescence. The results demonstrated that IPH administration significantly increased CPP scores in both male and female mice. Moreover, acute administration of IPH produced hyperlocomotion. In the BS test, repeated IPH exposure induced robust BS and exhibited IPH-primed expression of locomotor sensitization following withdrawal phase. Notably, SCH23390, a D1 receptor antagonist, blocked both IPH-induced CPP and the expression of BS, whereas raclopride, a D2 receptor antagonist, had no effect. Furthermore, chemogenetic inhibition of D1R-MSNs using Gi-coupled designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) prevented the expression of IPH-induced CPP. At the molecular level, IPH administration elevated dopamine concentrations in both the NAc and the VTA, which subsequently led to the activation of D1DR downstream signaling pathway in the NAc. These dopaminergic alterations were accompanied by increased c-Fos positive neurons and DAT levels in the NAc, and decreased TH levels in the VTA. Crucially, the blockade of D1DR attenuated these molecular alterations in the NAc and the VTA. Taken together, these results suggest that IPH induces addiction-related behaviors through modulation of the dopaminergic pathway, primarily via D1DR-dependent signaling.

국문 초록 (Abstract)

이소프로필페니데이트는 (IPH) 중추신경계 (CNS) 자극제로, 주의력 결핍/과잉행동 장애 (ADHD) 치료에 널리 사용되는 메틸페니데이트 (MPH)의 구조적 유사체이다. 정신자극제는 일반적으로 도파민 시스템을 통해 중독 유사 특성을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다. IPH는 최근 메스암페타민과의 약리학적 유사성 및 부작용으로 인해 규제 약물로 지정되었다. 하지만, IPH의 중독 특성과 도파민 시스템 기반 기저 메커니즘은 완전히 연구되지 않았다. 본 연구에서는 조건화 장소 선호도 (CPP) 및 행동 민감화 (BS) 패러다임을 활용하여 마우스에서 IPH의 남용 가능성을 평가하였다. 이후, 도파민 신호 전달의 연관성을 추가 연구하기 위해, CPP와 BS 실험에서 도파민 수용체 길항제를 투여하였으며, 특히 CPP에서는 별도의 실험군에서 화학유전학적 접근법을 통해 측좌핵 (NAc) 내 도파민 D1 수용체 (D1DR) 발현 중간 가시 신경세포 (MSNs)을 선택적으로 억제하였다. 이후 효소면역측정법, 웨스턴 블롯 및 면역형광법 등의 분자적 실험법을 이용하여 NAc와 복측 피개 영역 (VTA) 내 도파민 농도와 도파민 관련 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 연구 결과, IPH 투여는 수컷과 암컷 마우스 모두에서 CPP 점수를 유의하게 증가시켰다. 또한, IPH 단회 투여는 과잉 행동을 유발하였다. BS 실험에서. IPH의 반복적 노출은 강력한 행동 민감화를 유도하였고, 금단 기간 이후 민감화 발현을 보였다. 중요하게도, D1 수용체 길항제인 SCH23390은 IPH 유도 CPP와 BS의 발현을 모두 차단한 반면, D2 수용체 길항제인 raclopride는 어떠한 영향도 미치지 않았다. DREADD를 이용한 D1-MSN의 화학유전학적 억제 또한 IPH 유도 CPP 발현을 억제하였다. 분자적 결과에서, IPH 투여는 NAc와 VTA 모두에서 도파민 농도를 유의적으로 상승시켰으며, 이는 NAc 내 D1DR 하위신호 전달 경로의 활성화를 유발했다. 이러한 도파민성 변화는 NAc에서 c-Fos 양성 신경세포와 도파민 수송체 발현 증가, 그리고 VTA에서 TH 수준의 감소를 동반하였다. 가장 주목할 점은, D1DR의 차단이 NAc와 VTA에서의 이러한 분자적 변화 또한 억제했다는 것이다. 종합적으로, 이러한 결과들은 IPH가 주로 D1DR 의존적 신호 전달을 중심으로 한 도파민 경로 조절을 통해 중독 관련 행동을 유발함을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• 1. Isopropylphenidate 1
• 2. Dopamine and mesolimbic pathway 4
• 3. Dopaminergic mechanism underlying IPH addiction 6
• 4. Aims of study 8
• Ⅱ. MATERIALS & METHODS 9
• 1. Animals 9
• 2. Drugs 10
• 3. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) 10
• 4. Stereotaxic surgery 12
• 5. Conditioned place preference test 13
• 5.1 Apparatus 13
• 5.2 Induction of IPH CPP 14
• 5.3 Inhibition of dopamine receptors 15
• 5.4 Chemogenetic inhibition of D1R-MSNs 16
• 6. Locomotor activity test 16
• 6.1 Apparatus 16
• 6.2 IPH-induced hyperlocomotion 17
• 6.3 IPH-induced behavioral sensitization and challenge 17
• 6.4 Inhibition of dopamine receptors 18
• 7. Brain sample preparation 19
• 8. Dopamine enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 20
• 9. Western blot 22
• 10. Immunofluorescence 24
• 11. Statistical analysis 25
• Ⅲ. RESULTS 26
• 1. Behavioral effects of IPH 26
• 1.1 IPH induces rewarding effect 26
• 1.2 Acute administration of IPH induces hyperlocomotion 28
• 1.3 Repeated IPH administration induces behavioral sensitization 30
• 2. Role of dopaminergic signaling in IPH-induced behavioral alterations 33
• 2.1 D1DR antagonist inhibits IPH-induced CPP 33
• 2.2 D1DR antagonist inhibits IPH-induced behavioral sensitization 35
• 2.3 Chemogenetic inhibition of D1R-MSNs attenuates IPH-induced CPP 38
• 3. D1DR-dependent molecular and cellular changes in the dopaminergic system following IPH exposure 40
• 3.1 IPH significantly elevates dopamine levels in both the NAc and the VTA 40
• 3.2 D1DR antagonist inhibits IPH-induced decrease in TH expression in the VTA 42
• 3.3 D1DR antagonist inhibits IPH-induced D1DR expression in the NAc 44
• 3.4 D1DR antagonist inhibits IPH-induced dopaminergic protein expressions in the NAc 46
• 3.5 D1DR antagonist blocked IPH-induced increase in c-Fos expression in the NAc 49
• Ⅳ. DISCUSSION 51
• 1. The inhibition of D1DR attenuates IPH-induced CPP acquisition 51
• 2. The inhibition of D1DR suppresses IPH-induced behavioral sensitization 55
• 3. D1DR antagonism modulates IPH-induced changes of dopaminergic protein expressions in the NAc 57
• 4. IPH-induced dopamine elevation is primarily associated with alterations in dopamine transporter function and expression 62
• Ⅴ. CONCLUSION 65
• Ⅵ. REFERENCES 67
• 논문요약 86