Discovery of Gut Physiology Modulating Metabolites from the Human Gut Bacterium Enterococcus durans = 사람 장내세균 Enterococcus durans 유래 장 생리 조절 대사물질의 발견|RISS 상세보기

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Enterococcus durans KCTC 3121 is a gut-associated lactic acid bacterium that has been proposed as a potential probiotic. While its beneficial role in host physiology is well-recognized, the specific compounds responsible for these effects remain largely unknown. Here, we set out to identify and describe metabolites produced by this strain that could be related to these biological properties. Seven new N-terminally modified oligopeptides (E-1 ~ E-7) were isolated from E. durans KCTC 3121 along with known three compounds (E-8 ~ E-10). Structure elucidation of these compounds (E-1 ~ E-10) was confirmed by NMR, TOF-MS, and MS/MS analyses. Furthermore, the absolute stereochemistry of the constituent amino acids was confirmed using Marfey’s method and GITC derivatization, while the configuration of the N-lactic acid moiety was assigned by LC-MS/NMR comparison with synthetic standards and by reference to reported data. Of these metabolites, E-1 ~ E-4 were isolated in enough amounts to perform initial functional assays, such as MIC and experiments in intestinal organoids. Taken together, these findings define a set of metabolites produced by E. durans and provide an initial hint that they may be involved in the modulation of gut physiology.

번역하기

국문 초록 (Abstract)

E. durans는 장내미생물로, 항당뇨, 항알츠하이머, 항염증, 항균 활성 등 다양한 생리활성을 가지고 있는 잠재적 프로바이오틱 균주로 알려져 있다. 그러나 이러한 생리활성을 유도하는 특정 대사산물들은 거의 규명되지 않았다. 본 연구에서는 E. durans가 생성하는 신규 생리활성 대사산물을 발굴하고 그 구조를 규명하고자 하였다. E. durans를 대량 배양한 후 배양액을 추출 및 분획하여 LC-MS와 TOF-MS로 분석 후 주요 피크를 선별한 뒤 HPLC를 이용하여 개별 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물은 NMR 및 MS/MS 분석을 통해 화학구조를 구명하였고, 그 결과 물질들이 N-말단이 변형된 올리고펩타이드 계열과 N-아실 아마이드 계열 물질임을 확인하였다. 분리한 화합물들의 절대구조는 Marfey’s method와 GITC derivatization을 비롯하여 합성 표준품과의 비교 및 문헌 자료와의 대조를 통해 결정하였다. 추가적으로 일부 화합물을 산화시켜 비교한 결과, 몇몇 분리된 화합물이 다른 화합물의 산화 형태임을 확인하였다. 한편, 충분한 양이 확보된 화합물에 한정하여 수행한 항미생물 활성 평가에서, E-1 ~ E-4는 그람양성균, 그람음성균 및 진균에 대한 활성은 관찰되지 않았다. 마지막으로 충분한 양이 확보된 E-1 ~ E-4에 대한 장 오가노이드를 이용한 활성 평가를 수행한 결과, 네 가지 물질 모두 장 생리 기능 조절과 관련된 지표에서 대체로 유리한 변화를 보였다. 그 중에서도 E-2는가 가장 일관적이고 뚜렷한 효과가 보였는데, 장 상피장벽을 강화하면서 과도한 증식과 염증반응을 낮추는 방향으로 작용하는 물질로 해석할 수 있었다. 이를 통해 E. durans 유래 올리고펩타이드가 장 생리 기능 조절에 관여할 수 있음을 시사한다.

번역하기

E. durans는 장내미생물로, 항당뇨, 항알츠하이머, 항염증, 항균 활성 등 다양한 생리활성을 가지고 있는 잠재적 프로바이오틱 균주로 알려져 있다. 그러나 이러한 생리활성을 유도하는 특정 ...

목차 (Table of Contents)

Chapter 1. Introduction 1
Chapter 2. Materials and Methods 4
1. Materials 4
1.1. Bacterial Sources 4
1.2. General Experimental Procedures 5

Chapter 1. Introduction 1
Chapter 2. Materials and Methods 4
1. Materials 4
1.1. Bacterial Sources 4
1.2. General Experimental Procedures 5
2. Cultivation and Extraction 7
2.1. Cultivation of E. durans and metabolites analysis 7
2.2. Extraction and Isolation 7
3. MS/MS fragmentation analysis 22
4. Marfey’s method 23
4.1. Standard Marfey’s Analysis 23
4.2. Advanced Marfey’s Analysis 24
5. GITC Derivatization 25
6. Synthetic Standard Comparison 26
7. Formation of E-2 from E-1 and E-4 from E-3 via oxidation 27
8. MIC (Minimum Inhibitory Concentration) Assay 28
9. Gut Metabolites Functional Evaluation using Intestinal Organoids 30
9.1. Preparation and Culture of Intestinal Organoids 30
9.2. Generation of Intestinal Epithelial Monolayers 31
9.3. Metabolites Treatment 31
9.4. Immunohistochemistry (IHC) 32
9.5. RNA Isolation and Quantitative Real-Time PCR (qPCR) 33
9.6. Morphology Assessment 33
Chapter 3. Results and Discussion 34
1. Structure Elucidation of Isolated Compounds 34
1.1. The Structure of Compound E-1 34
1.2. The Structure of Compound E-2 40
1.3. The Structure of Compound E-3 46
1.4. The Structure of Compound E-4 52
1.5. The Structure of Compound E-5 57
1.6. The Structure of Compound E-6 62
1.7. The Structure of Compound E-7 67
1.8. The Structure of Compound E-8 73
1.9. The Structure of Compound E-9 76
1.10. The Structure of Compound E-10 79
2. MS/MS-based Structural Elucidation 82
3. Determination of the Absolute Configuration 86
3.1. Amino Acid Configuration by Standard Marfey’s Method 86
3.2. Amino Acid Configuration by Advanced Marfey’s Method 87
3.3. Amino Acid Configuration by GITC Derivatization 93
3.4. N-Lactoyl (OH) Configuration of E-1 and E-2 by Comparison with Synthetic (S)/(R) Standards (LC-MS/NMR) 95
4. Formation of E-2 from E-1 and E-4 from E-3 via oxidation 98
5. MIC Assay 103
6. Gut Metabolites Functional Evaluation using Intestinal Organoids 106
Chapter 4. Conclusion 110
References 112
논문요약 114