Development of rapid and easy colorimetric sensor for blood and semen detection (Bld-ID, Sem-ID)

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Presumptive tests for blood and semen, while not mandatory in forensic investigations, are useful for improving initial on-site decision-making and the efficiency of subsequent evidence collection. However, conventional tests are limited by poor reagent stability, multistep procedures, and false-positive reactions. To address these limitations, this study developed and forensically evaluated presumptive test systems for blood and semen, termed Bld-ID and Sem-ID.

The blood presumptive test system, Bld-ID, employs a single-step colorimetric reaction based on 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) and cumene hydroperoxide (CHP). Both solution-based and paper-based formats reliably detected blood up to a 1:3,125 dilution. Although its absolute sensitivity was lower than that of Hemastix® and URiSCAN®, Bld-ID showed higher sensitivity than Peroxtesmo KM paper and markedly fewer false-positive reactions. The paper-based format remained stable for more than six months, while the solution-based format was most stable under frozen storage, and the feasibility of conversion into a lyophilized bead format was also confirmed. Despite partial DNA recovery loss, degradation index values were maintained, and full short tandem repeat (STR) profiles were obtained when sufficient DNA was available.

The semen presumptive test system, Sem-ID, was established as a two-step colorimetric assay using phenolphthalein bisphosphate (PBP). Time-dependent sensitivity was achieved using a PBP–NaOAc buffer (pH 5.1–5.2) followed by pH 13 NaOH, enabling detection up to 1:625 at 3 min and 1:3,125 at extended reaction times. Under the standardized 3-min condition, both formats provided reliable detection with sufficient specificity and two-week stability. DNA quantity and integrity were preserved following Sem-ID treatment, although further validation of STR profiling consistency is required.

Overall, Bld-ID and Sem-ID provide field-oriented presumptive test systems with practical sensitivity, stability, and compatibility with downstream DNA analysis, offering robust alternatives to conventional forensic presumptive tests.

국문 초록 (Abstract)

혈액과 정액의 예비검사는 법과학 수사에서 필수 절차는 아니지만, 현장 초기 판단의 정확성을 높이고 후속 증거 수집 및 분석의 효율성을 향상시키는 데 중요한 역할을 한다. 그러나 기존 예비검사법은 다단계 반응, 낮은 시약 안정성, 위양성 발생 가능성 등으로 인해 실제 현장 적용에 한계를 보여 왔다. 본 연구에서는 이러한 실무적 문제를 개선하기 위해, 혈액 및 정액 예비검사 시스템(Bld-ID 및 Sem-ID)을 각각 개발하고 법과학적 유효성을 평가하였다.

혈액 예비검사 시스템인 Bld-ID는 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) /cumene hydroperoxide (CHP) 기반의 1단계 비색 반응으로 설계되었으며, 용액형과 종이형 모두에서 혈액을 1:3,125 희석까지 검출하였다. Bld-ID는 Peroxtesmo KM paper보다 높은 민감도를 보였고, Hemastix® 및 URiSCAN®에 비해 절대 민감도는 낮았으나 위양성 발생이 적어 해석 신뢰성이 높았다. 종이형은 6개월 이상 안정성을 유지하였고, 용액형은 냉동 보관 시 가장 안정적이었으며 동결건조 비드로의 전환 가능성도 확인되었다. DNA 회수율은 일부 감소하였으나 degradation index (DI)는 유지되었고, 충분한 DNA 조건에서는 정상적인 short tandem repeat (STR) 프로파일 획득이 가능하였다.

정액 예비검사 시스템인 Sem-ID는 기존 1-naphthyl phosphate/Fast Blue B salt 기반 시약의 불안정성을 개선하기 위해, phenolphthalein bisphosphate (PBP)를 기질로 하는 2단계 비색 반응계로 구축되었다. PBP–NaOAc buffer(pH 5.1–5.2)와 pH 13 NaOH를 적용함으로써 1:125(30–60초), 1:625(3분), 1:3,125(30분)까지 시간 의존적인 민감도 조절이 가능하였으며, 표준 반응 시간인 3분 조건에서 용액형 및 종이형 모두 1:625 희석까지 안정적인 검출 성능과 충분한 특이성을 보였다. 또한 용액형과 종이형 모두에서 2주간의 단기 안정성이 확인되었으며, 수용성 조성으로 인해 동결건조가 가능하고 재용해 후에도 분석 성능이 유지되었다. DNA 분석 결과, DNA의 양과 무결성은 유지되었으나 STR 분석의 일관성에 대해서는 추가 검증이 필요함을 확인하였다.

종합적으로, Bld-ID와 Sem-ID는 각각 혈액과 정액의 현장 선별에 요구되는 민감도, 선택성, 안정성, 그리고 DNA 분석과의 호환성을 갖춘 현장 지향적 예비검사 시스템으로, 기존 예비검사법의 한계를 보완할 수 있는 실질적인 대안으로 평가된다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• 1.1. DNA Evidence 1
• 1.2. Forensic DNA Workflow 4
• 1.3. Biological Evidence: Lessons from Casework 11
• 1.3.1. Blood Misinterpretation Cases 11
• 1.3.2. Semen Collection Challenges in Sexual Assault Cases 13
• 1.4. Commercial Presumptive Kits 16
• 1.4.1. Commercial Presumptive Blood Tests 17
• 1.4.2. Commercial Presumptive Semen Tests 19
• 1.5. Purpose of the study 22
• 1.6. Rationale for Compound Selection 24
• 1.6.1. Bld-ID Key Compound 24
• 1.6.2. Sem-ID Key Compound 28
• Chapter 2. Materials and Methods 31
• 2.1. Preparation of Body Fluids 31
• 2.2. Preparation of Reagents and Equipment 33
• 2.2.1. Bld-ID 33
• 2.2.2. Sem-ID 34
• 2.3. Preparation of Conventional Reagents and Kits 36
• 2.3.1. Conventional Blood Detection Methods 36
• 2.3.2. Conventional Semen Detection Methods 39
• 2.4. Optimization Process 40
• 2.4.1. Bld-ID Formulation 40
• 2.4.2. Sem-ID Formulation 42
• 2.5. Forensic Validation of Bld-ID 45
• 2.5.1. Sensitivity tests 45
• 2.5.2. Specificity tests 46
• 2.5.3. Stability tests 47
• 2.5.4. Field Applications 48
• 2.5.5. Effects on DNA profiling 50
• 2.6. Forensic validation of Sem-ID 60
• 2.6.1. Sensitivity tests 60
• 2.6.2. Specificity tests 62
• 2.6.3. Stability tests 63
• 2.6.4. Effects on DNA profiling 64
• 2.7. Performance Evaluation 69
• 2.7.1. Setting Color Intensity Scale using RGB Values 70
• 2.7.2. Data Analysis using Python 71
• Chapter 3. Results and Discussion 74
• 3.1. Decision of Bld-ID Composition 74
• 3.2. Forensic Validation of Bld-ID 80
• 3.2.1. Sensitivity tests 80
• 3.2.2. Specificity tests 81
• 3.2.3. Stability tests 84
• 3.2.4. Field Application 97
• 3.2.5. DNA Effects 101
• 3.3. Decision of Sem-ID Composition 108
• 3.3.1. Preliminary Validation of PBP for Semen Detection 110
• 3.3.2. Sem-ID 1st Solution 114
• 3.3.3. Sem-ID 2nd Solution 124
• 3.4. Forensic Validation of Sem-ID 127
• 3.4.1. Sensitivity tests 127
• 3.4.2. Specificity tests 131
• 3.4.3. Stability tests 135
• 3.4.4. DNA Effects 140
• 3.4.5. Potential Application 144
• Chapter 4. Conclusion 146
• 4.1. Bld-ID 146
• 4.2. Sem-ID 150
• References 154
• Appendix 162
• 논문요약 174