Controllable metabolic dysfunction-associated steatohepatitis model using a multi-inlet spheroid generator

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Three-dimensional (3D) microphysiological systems that merge microfluidics with accessible fabrication routes provide a controllable way to model metabolic liver disease in vitro while retaining essential multicellular interactions. This thesis develops a MSG to assemble reproducible hepatocyte–stellate co-cultures and to orchestrate stepwise perturbations that emulate key features of metabolic dysfunction–associated steatohepatitis. The platform stabilizes hanging-drop cultures, supports uniform spheroid formation, and permits non-disruptive, temporally precise reagent exchanges suited to longitudinal studies and comparative assays. Within this ecosystem, steatosis, oxidative stress, inflammatory signaling, and matrix remodeling are profiled through imaging and transcript readouts to yield an integrated view of disease-relevant
phenotypes. Methodologically, the work emphasizes manufacturability, workflow robustness, and compatibility with standard plate formats to promote adoption, reduce operator variance, and enable parallel condition testing. Conceptually, it positions microfabricated liver spheroids as a bridge between oversimplified two-dimensional (2D) cultures and resource-intensive
animal models, highlighting advantages for dissecting timing, dose, and sequence of stimuli as well as for evaluating combination interventions. The closing perspective outlines extensions to patient-derived inputs, gradient generators for microenvironment control, and automation for medium-throughput screening, underscoring the potential of this approach to accelerate discovery and prioritization of anti-steatotic, anti-oxidative, and anti-fibrotic strategies while reducing cost and ethical burdens.

국문 초록 (Abstract)

대사 기능 장애 관련 지방간염(Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis, MASH)은 전 세계적으로 유병률이 급증하고 있는 만성 간질환으로, 간세포 내 지질 축적, 산화 스트레스, 염증 반응 및 섬유화가 복합적으로 진행되는 질환이다. 그러나 기존의 2 차원 세포 배양 모델은 간의 복잡한 미세환경과 다세포 상호작용을 재현하는 데 한계가 있으며, 동물 모델은 인간 질환과의 병리학적 차이 및 높은 비용 문제로 인해 치료제 개발에 제약을 가진다. 이에 따라 생리학적 타당성과 실험적 제어성을 동시에 갖춘 인간 유래 생체외(in vitro) MASH 모델의 개발이 요구되고 있다.
본 연구에서는 3 차원 프린팅 기반의 다중 유입 스페로이드 생성기(Multi-Inlet Spheroid Generator, MSG) 를 이용하여, 조절 가능하고 재현성 있는 MASH 생체외 모델을 개발하였다. MSG 는 중앙 유입구를 통한 안정적인 스페로이드 형성과 측면 유입구를 통한 단계적 시약 주입이 가능한 구조로 설계되어, 기존 단일 유입구 행잉 드롭 시스템의 부피 제한과 스페로이드 붕괴 문제를 극복하였다. 본 플랫폼에서는 인간 간세포주(Huh7)와 간성상세포(LX-2)를 2:1 비율로 공동배양하여 스캐폴드 없는 3 차원 스페로이드를 형성한 후, 올레산(OA)과 팔미트산(PA)으로 구성된 유리지방산(FFA)을 단계적으로 처리하여 MASH 를 유도하였다. 그 결과, FFA 처리 스페로이드는 형태적 안정성과 약 95% 이상의 높은 세포 생존율을 유지하면서, 대조군 대비 약 2.4 배 증가한 지질 축적과 약 2.8 배 증가한 활성산소종(ROS) 생성을 보였다. 또한 실시간 정량 PCR 분석을 통해 염증 마커(IL-6)와 섬유화 관련 마커( α -SMA, collagen I)의 발현이 유의하게 증가함을 확인하여, 지질 축적–산화 스트레스–염증–초기 섬유화로 이어지는 MASH 의 핵심 병리 경로를 성공적으로 재현하였다.
더 나아가, 항산화 및 항염 효과가 보고된 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG)를 모델 약물로 적용한 결과, 지질 축적과 ROS 생성이 부분적으로 감소하고 염증 및 성상세포 활성화 지표가 완화되는 경향을 확인하였다. 이는 본 MSG 기반 MASH 모델이 단순한 질환 재현을 넘어, 약물 반응성을 평가할 수 있는 유효한 스크리닝 플랫폼으로 활용 가능함을 보여준다.
종합적으로, 본 연구에서 개발된 MSG 기반 MASH 생체외 모델은 지질 축적, 산화 스트레스, 염증 및 초기 섬유화를 동시에 재현하면서도, 복잡한 관류 시스템 없이 단계적 자극과 약물 처리가 가능한 제어성과 접근성을 제공한다. 본 플랫폼은 과도하게 단순화된 2D 배양 모델과 고비용의 장기칩·동물 모델 사이를 연결하는 중간 단계의 대안으로서, 향후 MASH 병태생리 연구 및 치료 후보 물질의 중간 처리량 스크리닝에 유용한 도구로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. General introduction. 1
• 1.1 Microfluidic devices 1
• 1.1.1 Fabrication of microfluidic devices 2
• 1.1.2 Physics of microfluidic conditions 5
• 1.1.3 Microfluidic cell culture systems (μFCCS). 6
• 1.1.4 Multi-inlet spheroid generator (MSG) . 10
• 1.2 In-Vitro models. 13
• 1.2.1 Various in vitro cell culture models. 14
• 1.3 Metabolic-dysfunction associated steatohepatitis (MASH) disease 17
• 1.3.1 MASH pathophysiology 18
• 1.3.2 Review of microfluidic culture of MASH models 21
• 1.3.3 Disease burden and unmet modeling needs. 26
• 1.4 Goal of this research . 29
• Chapter 2. MSG based in-vitro MASH modeling 30
• 2.1 Introduction 30
• 2.2 Materials and methods 33
• 2.2.1 Cell culture. 33
• 2.2.2 Spheroid Formation by MSG. 34
• 2.2.3 Free fatty acid (FFA) composed of Palmitic acid (PA) & oleic acid (OA) 35
• 2.2.4 FFA-based MASH induction 37
• 2.2.5 Epigallocatechin gallate (EGCG)-based drug screening validation 38
• 2.2.6 Cell viability assessment. 39
• 2.2.7 Lipid accumulation analysis by Nile Red staining . 40
• 2.2.8 Reactive oxygen species (ROS) detection 41
• 2.2.9 Gene expression analysis by RT-qPCR 42
• 2.2.10 Statistical analysis 43
• 2.3 Results. 44
• 2.3.1 Spheroid integrity & viability under FFA. 44
• 2.3.2 Lipid accumulation within MASH spheroids. 48
• 2.3.3 Changes in ROS levels detected by DHR123 staining 51
• 2.3.4 Changes in expression of inflammation- and fibrosis-related genes . 54
• 2.3.5 Evaluation of EGCG as a Therapeutic Candidate in MASH Spheroids 56
• 2.3.6 Discussion 66
• References. 67
• 논문요약. 74