Annexin A1-mediated therapeutic effect of extracellular vesicles derived from thrombin-preconditioned mesenchymal stromal cells in experimental necrotizing enterocolitis. = 신생아 괴사성 장염에서 트롬빈 전처리 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포체의 아넥신 A1 매개 치료 효과

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating inflammatory disease in premature infants lacking specific treatment. Extracellular vesicles from thrombin-preconditioned mesenchymal stromal cells (thMSC-EVs) show superior therapeutic efficacy over naïve MSC-EVs. This study aimed to identify the key enriched therapeutic factor and its mechanism in experimental NEC.
Methods: Comparative proteomic profiling (LC-MS/MS) of thMSC-EVs was performed to identify candidate proteins. NEC was induced in neonatal mice (P4) using formula feeding, LPS, and stress. thMSC-EVs were administered intraperitoneally. Whole transcriptomic (RNA-seq) and multi-omics ligand-receptor analyses of the mouse ileum integrated proteomic and transcriptomic data. The candidate, Annexin A1 (ANXA1), was validated using in vitro NEC models (HIT stress and LPS-induced inflammation), assessing viability (CCK-8), barrier integrity (ZO-1), and signaling (TLR4/NF-kB, Wnt/β-catenin) following treatment with the ANXA1 mimetic peptide (Ac2-26). The role of ANXA1 was confirmed using EVs from ANXA1-knockdown MSCs (siANXA1-MSC-EVs).
Results: Proteomic analysis showed thMSC-EVs were significantly enriched with anti-inflammatory proteins, including a 3-8-fold increase in ANXA1. In the NEC model, thMSC-EVs attenuated intestinal necrosis and apoptosis, suppressed mucosal immune response, and promoted tissue repair. Multi-omics ligand-receptor analysis identified the ANXA1-Formyl Peptide Receptor 2 (FPR2) interaction as the most prominent therapeutic axis. In vitro, the ANXA1 mimetic peptide Ac2-26 replicated the effects of thMSC-EVs, restoring cell viability/ZO-1 and suppressing TLR4/NF-kB while activating Wnt/β-catenin. Conversely, siANXA1-MSC-EVs demonstrated a markedly diminished therapeutic effect.
Conclusion: Thrombin preconditioning amplifies the ANXA1 content within MSC-EVs. This enriched ANXA1 exerts a dual therapeutic effect in NEC by suppressing TLR4/NF-kB-mediated inflammation and promoting Wnt/β-catenin-mediated epithelial regeneration via the FPR2 receptor. Our findings establish ANXA1 as a novel therapeutic target and thMSC-EVs as a potent cell-free therapeutic agent.

국문 초록 (Abstract)

배경: 괴사성 장염(NEC)은 조산아에게 발생하는 치명적인 염증성 장 질환으로 사망률이 높으며, 아직까지 특이적인 치료법이 확립되지 않았습니다. 이전 연구에서는 트롬빈 전처리된 중간엽 줄기세포(thMSC)에서 유래한 세포외 소포(thMSC-EVs)가 신생아 질환 모델에서 미처리 중간엽 줄기세포 유래 소포(naïve MSC-EVs)보다 우수한 치료 효과를 보인다는 사실을 입증했습니다. 본 연구는 트롬빈 전처리에 의해 풍부해진 핵심 치료 인자를 규명하고, 실험적 NEC에서 그 작용 기전을 밝히는 것을 목표로 했습니다.
방법: 치료 후보 단백질을 확인하기 위해 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 thMSC-EVs와 미처리 MSC-EVs의 비교 프로테오믹 프로파일링을 수행하였습니다. 생체 내 효과를 조사하기 위해 신생아 마우스(P4)에서 분유 급여, 경구 리포폴리사카라이드(LPS) 투여 및 저산소증/저체온 스트레스를 통해 NEC를 유도하였습니다. 이후 thMSC-EVs를 복강 내 투여하였습니다. NEC 유발 장에 대한 thMSC-EVs의 치료적 영향을 확인하기 위해 생쥐 회장(ileum)의 전사체 분석(RNA 시퀀싱)을 수행하였습니다. 이후 다중 오믹스 리간드-수용체 분석을 통해 프로테오믹스 및 전사체 데이터를 통합하였습니다. 확인된 후보 물질인 Annexin A1(ANXA1)을 검증하기 위해 고삼투압-허혈-저체온(HIT) 스트레스 모델 및 LPS 유발 염증 모델을 포함한 NEC 체외 모델을 활용했습니다. ANXA1 모방 펩타이드(Ac2-26) 처리 후 세포 생존율, 장벽 무결성(ZO-1), 염증성 사이토카인 및 주요 신호 전달 경로(TLR4/NF-kB, Wnt/β-catenin)를 평가하여 그 메커니즘을 추가로 조사했습니다. 마지막으로, ANXA1을 knockdown한 MSC(siANXA1-MSC-EVs)에서 유래한 엑소좀을 사용하여 ANXA1의 중추적인 역할을 확인했습니다.
결과: 선행 연구에서 단백질체 분석 결과, thMSC-EVs는 항염증 과정, 세포 접착 및 Wnt 신호전달 경로에 관여하는 단백질이 현저히 풍부하게 함유되어 있었으며, ANXA1은 미처리 MSC-EVs 대비 3.8배 증가한 것으로 나타났습니다. NEC 마우스 모델에서 thMSC-EVs는 장 괴사 및 세포 사멸을 유의하게 억제하였습니다. 전사체 분석 결과, thMSC-EV는 NEC 장에서 과도하게 활성화된 점막 면역 반응을 억제하고 조직 회복 경로를 촉진하는 것으로 나타났습니다. 다중 오믹스 리간드-수용체 분석을 통해 thMSC-EV 유래 ANXA1과 장 세포 표면의 수용체인 포르밀 펩타이드 수용체 2(FPR2) 간의 상호작용이 가장 두드러진 치료적 축으로 확인되었습니다. 체외 실험에서 ANXA1 모방 펩타이드 Ac2-26은 thMSC-EVs의 효과를 재현하여 HIT 모델에서 세포 생존율과 ZO-1 발현을 회복시키는 동시에, 염증 모델에서 TLR4/NF-kB 경로를 억제하고 Wnt/β-catenin 경로를 활성화했습니다. 반대로, siANXA1-MSC-EV는 치료 효과가 현저히 감소하여 ANXA1이 thMSC-EV의 보호 기능의 핵심 매개체임을 확인했습니다.
결론: 트롬빈 전처리방식으로 풍부해진 ANXA1은 FPR2 수용체를 통해 TLR4/NF-κB 매개 염증을 억제하고 Wnt/β-catenin 매개 상피 재생을 촉진함으로써 NEC에서 이중 치료 효과를 발휘합니다. 본 연구 결과는 ANXA1을 NEC의 새로운 치료 인자로 확립하고, thMSC-EVs를 NEC 치료제로서의 잠재력을 강조하는 결과입니다.

목차 (Table of Contents)

• 1.Introduction 1
• 2.Materials and Methods 3
• 2.1.Ethics statements 3
• 2.2.Production and Characterization of MSC-Derived Extracellular Vesicles 4
• 2.3.Comparative Proteomic Analysis of EV Cargo 5
• 2.4.NEC mouse model 5
• 2.5.in vitro model 7
• 2.6.Confirmation of Annexin-A1-mediated effects 7
• 2.7.Transcriptomic Analysis of Intestinal Tissue (RNA Sequencing) 8
• 2.8.Integrated Multi-Omics Ligand-Receptor Interaction Analysis 9
• 2.9.Histological Analyses 9
• 2.10.Biochemical Analysis 10
• 2.11.Statistical Analysis 11
• 3.Results 13
• 3.1.Proteomic comparison between thMSC-EVs and naveMSC-EVs . 13
• 3.2.thMSC-EVs significantly ameliorated cell death and tissue necrosis in vivo. 13
• 3.3.Tissue transcriptomic analysis demonstrated distinct inflammatory patterns in the NEC group. 14
• 3.4.Integrated ligand-receptor analysis 15
• 3.5.ANXA1 Mediates the Cytoprotective and Anti-inflammatory Effects of thMSC-EVs by inhibiting AKT pathway in in vitro NEC Models. 16
• 3.6.Knockdown of Annexin A1 abrogates the therapeutic efficacy of thMSC-EVs. 19
• 4.Discussion 21
• 5.Reference 26
• 6.Abstract in Korean 38