MCF7 및 T47D 유방암 세포에서 에스트로겐 수용체 알파 (ERα)에 의한 SVCT2 단백질 발현 조절 연구

국문 초록 (Abstract)

에스트로겐 수용체 알파 (estrogen receptor alpha, ERα)는 호르몬 수용체 양성 유방암에서 세포의 성장과 생존을 조절하는 핵심 인자로 알려져 있다. 한편, 세포 내 비타민 C 흡수를 담당하는 운반체인 sodium-dependent vitamin C transporter 2 (SVCT2)는 산화환원 항상성 및 세포 생존과 관련된 다양한 생물학적 과정에 관여하며, 최근 일부 암에서 기능적 중요성이 제기되고 있다. 본 연구에서는 유방암 세포에서 ERα가 SVCT2 단백질 발현에 미치는 영향과 해당 조절 기전에 대해 분석하고자 하였다.
먼저 MCF7과 T47D 세포에서 ERα 발현을 억제한 결과, SVCT2 단백질 수준이 ERα 감소와 함께 저하되는 양상을 보였다. ERα를 내재적으로 발현하지 않는 COS7 세포에서도 동일한 경향을 보여 두 단백질 간 연관성을 확인하였다. 반면 ERα의 과발현은 SVCT2 단백질 수준에 뚜렷한 변화를 보이지 않아, ERα가 SVCT2 단백질 안정성 조절에 관여할 가능성을 보였다.
이러한 가능성을 확인하기 위해 cycloheximide를 이용한 단백질 안정성 분석을 한 결과, ERα 발현 억제 조건에서 SVCT2 단백질의 분해 속도가 증가하였다. 또한 proteasome 억제제 MG132는 ERα 발현 억제에 의해 감소된 SVCT2 단백질을 부분적으로 회복시킨 반면, lysosomal protease 억제제 leupeptin은 유의한 영향을 보이지 않았다. 이는 ERα 결핍 시 SVCT2 분해가 주로 ubiquitin-proteasome 경로를 통해 이루어질 가능성을 보여주었다.
SVCT2의 분해 과정에 관여할 수 있는 조절 인자를 찾아본 결과, ERα 발현이 억제된 세포에서 E3 ubiquitin ligase인 X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP)의 단백질 수준이 증가하였다. 또한 XIAP를 ERα와 동시에 발현 억제하였을 때, ERα 감소로 저하된 SVCT2 단백질 수준이 부분적으로 회복되었다. 면역침강 (immunoprecipitation) 분석에서는 XIAP 과발현 시 SVCT2의 유비퀴틴화가 증가하고 XIAP 발현 억제 시 감소하는 양상을 확인하여, XIAP가 ERα 결핍 환경에서 SVCT2 유비퀴틴화 조절에 관여할 가능성을 보였다.
종합적으로, 본 연구는 ERα가 유방암 세포에서 SVCT2 단백질 안정성 조절에 영향을 줄 수 있으며, 이 과정에서 XIAP가 부분적으로 기여할 가능성을 제시한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Estrogen receptor alpha (ERα) is an important regulator of cell growth and survival in hormone receptor–positive breast cancer. Sodiumdependent vitamin C transporter 2 (SVCT2) is responsible for intracellular vitamin C uptake and is involved in redox homeostasis and cell survival.
However, the regulatory relationship between ERα and SVCT2 in breast cancer cells remains unclear. In this study, we investigated the effect of
ERα on SVCT2 protein expression and its regulatory mechanism in breast cancer cells.
Knockdown of ERα in MCF7 and T47D cells led to a decrease in SVCT2 protein levels. A similar reduction was observed in COS7 cells, which do not endogenously express ERα, indicating an association between ERα and SVCT2 protein levels. In contrast, overexpression of ERα did not cause a significant change in SVCT2 protein levels, suggesting that ERα may be involved in the regulation of SVCT2 protein stability rather than its expression.
Cycloheximide chase experiments showed that depletion of ERα accelerated SVCT2 protein degradation. The proteasome inhibitor MG132 partially
restored SVCT2 protein levels reduced by ERα knockdown, whereas the lysosomal protease inhibitor leupeptin had no significant effect. These results indicate that SVCT2 degradation under ERα-deficient conditions is mainly mediated by the ubiquitin–proteasome pathway.
Further analysis showed that the protein level of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP), an E3 ubiquitin ligase, was increased following ERα knockdown. Simultaneous knockdown of XIAP partially rescued the reduction in SVCT2 protein levels caused by ERα depletion. In addition, immunoprecipitation analysis demonstrated increased ubiquitination of SVCT2 upon XIAP overexpression and decreased ubiquitination following XIAP knockdown.
In conclusion, these findings suggest that ERα plays a role in maintaining SVCT2 protein stability in breast cancer cells, and that XIAP may partially contribute to SVCT2 ubiquitination under ERα-deficient conditions.

목차 (Table of Contents)

• LIST OF FIGURES ⅱ
• 국 문 초 록 ⅲ
• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 재료 및 연구 방법
• 1. 세포 배양 및 재료 3
• 2. siRNA를 이용한 발현 억제 4
• 3. 플라스미드를 이용한 과발현 4
• 4. Western blot 5
• 5. Immunoprecipitation 6
• Ⅲ. 결과
• 1. ERα의 발현 억제는 SVCT2 단백질 수준을 감소시킨다. 7
• 2. ERα 과발현은 SVCT2 단백질 수준을 변화시키지 않는다. 9
• 3. p53 발현 억제는 SVCT2 단백질 수준을 증가시킨다. 11
• 4. ERα는 SVCT2 단백질 안정성과 분해를 조절하는데 관여한다. 13
• 5. XIAP는 SVCT2의 proteasomal degradation에 관여한다. 16
• Ⅳ. 결론 및 고찰 20
• 참 고 문 헌 22
• ABSTRACT 25