Carbothioamide 유도체의 암세포주별 항암 활성 차이 및 표적 단백질 예측 연구

국문 초록 (Abstract)

Carbothioamide 유도체는 다양한 kinase 억제 활성과 항암 가능성이 보고된 화합물이지만, 암세포의 분자적 이질성으로 인해 약물 반응성이 크게 달라질 수 있다. 본 연구에서는 이러한 선택적 반응성의 특성을 이해하고, dipehnylpyrazoline-1-carbothioamide 유도체(DK-321, DK-327, DK-328, DK-333)가 나타내는 세포주별 항암 활성 패턴을 정량적으로 비교하여 반응성 차이를 설명할 수 있는 잠재적인 표적 단백질을 예측하고자 하였다. 이를 위해 13종의 인간 암세포주 및 2종의 비종양성 인간 세포주에서 MTS assay를 수행하고, 24시간 및 48시간 처리 조건에서 세포 생존율과 IC50 값을 정량하였다.
실험 결과, 네 화합물은 특정 세포주에서만 선택적으로 세포 생존율을 감소시켰으며, 특히 대부분의 대장암(HCT116, HCT-15, SW620, SW480) 세포주와 일부 위암(AGS) 세포주 및 각질세포주(HaCaT)에서 48시간 처리 시 높은 약물 감수성이 관찰되었다. 반면 폐암(A549, H460)과 유방암(MCF7, MDA-MB-231) 등의 세포주에서는 최고 처리 농도인 20 μM에서도 생존율 감소가 거의 없는 것으로 보아 내성이 두드러졌다. 전반적으로 24시간보다 48시간에서 더 큰 독성이 나타나 화합물의 시간 의존적인 특성을 확인하였다.
이러한 선택적 항암 활성의 기전을 이해하고, 앞서 48시간 조건에서 높은 감수성을 보였던 대장암 세포주(HCT116, HCT-15, SW620, SW480)의 반응성을 설명하기 위해 GalaxySagittarius-AF를 사용하여 DK 화합물과 결합 가능한 단백질 후보를 예측하고, 선정된 단백질 후보를 다시 Open Targets platform의 질병-표적 연관성 정보와 통합 분석하였다. 두 가지 분석도구의 결과 상, EGFR, BRAF, ERBB2 등이 공통적으로 높은 점수를 보이며 대장암 계열 세포주의 감수성과 연관성이 높은 표적 후보로 선정되었다.
표적 단백질 예측 결과를 바탕으로, 네 화합물 중 가장 일관된 세포독성을 보인 DK-327과 선정된 세 단백질 간의 직접적인 결합 양상을 확인하기 위해 in silico 도킹(docking) 분석을 수행하였다. 공결정 리간드(co-crystal ligand)의 재도킹(redocking) 분석을 통해 방법론의 타당성과 예측된 결합 포켓의 정확성은 확인하였으나, DK-327은 높은 리간드 변형 에너지(ligand strain energy)와 제한적인 수소결합 패턴을 보여 예측된 표적이었음에도 불구하고 EGFR, BRAF, ERBB2와 강한 결합 친화도를 형성하기에는 구조적 제약이 있는 것으로 나타났다.
결론적으로, 본 연구의 표적 예측 과정에서 높은 우선순위를 보인 단백질이 in silico 도킹 분석에서는 DK-327과 제한적인 결합 친화도를 보이는 불일치를 확인하였다. 이러한 결과는 계산 기반 표적 탐색이 제시하는 후보 단백질과 실제 약물-단백질 상호작용 간에 차이가 존재할 수 있다는 한계점과, 실제 생체 내 상호작용의 복잡성을 시사하며 예측된 표적에 대한 후속 실험적 검증의 필요성을 강조한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Carbothioamide derivatives are a class of molecules reported to possess various kinase inhibitory activities and potential anticancer properties. However, their drug responsiveness can vary greatly due to the molecular heterogeneity of cancer cells. In this study, we aimed to understand the characteristics of this selective responsiveness by quantitatively comparing the anticancer activity patterns exhibited across multiple cell lines by pyrazoline-1-carbothioamide derivatives (DK-321, DK-327, DK-328, DK-333) and to predict potential target proteins that could explain these patterns. To this end, MTS assays were performed on 13 cancer cell lines and one non-malignant cell line, and cell viability and IC₅₀ values were measured after 24 h and 48 h treatment conditions.
These compounds selectively reduced cell viability only in certain cell lines, with particularly high sensitivity observed after 48 h of treatment in colorectal cancer cell lines (HCT116, HCT-15, SW620, SW480) as well as in gastric cancer line (AGS) and the HaCaT keratinocyte line. In contrast, A549, MCF7, MDA-MB-231, and H460 cells showed little to no decrease in viability even at 20 μM, indicating pronounced resistance to the test drugs. Overall, greater cytotoxicity was observed at 48 h than at 24 h, suggesting that the treatment effects are time-dependent.
Furthermore, to investigate the mechanism underlying this selective anticancer activity and to account for the responsiveness of colorectal cancer cell lines that showed high sensitivity at 48 h, we used GalaxySagittarius-AF to predict candidate protein targets and integrated these results with disease–target association data from the Open Targets platform. As a result, EGFR, BRAF, and ERBB2 were commonly identified by both analysis tools, with high scores. Therefore, the three proteins were selected as candidate targets strongly associated with the observed sensitivity of colorectal cancer cell lines.
Based on these predictions, an in silico docking analysis was performed to examine the direct binding patterns between DK-327—the compound that showed the most consistent cytotoxicity among the four derivatives—and the three selected proteins. Through redocking of the co-crystal ligands, the validity of the docking protocol and the accuracy of the predicted binding pockets were confirmed. However, although DK-327 was predicted as a potential target-binding compound, it exhibited high ligand strain energy and limited hydrogen-bonding interactions indicating structural constraints that prevent strong binding affinity to EGFR, BRAF, and ERBB2.
In conclusion, these findings highlight the limitation that candidate proteins suggested by computational screening may not necessarily reflect actual drug–protein interactions, emphasize the complexity of real in vivo interactions, and underscore the need for subsequent experimental validation of the predicted targets.

목차 (Table of Contents)

• LIST OF TABLES_ⅲ
• LIST OF FIGURES_ⅳ
• 국문 초록_ⅴ
• Ⅰ. 서 론_1
• Ⅱ. 재료 및 연구 방법
• 1. Cell culture_3
• 2. Reagents and compounds_3
• 3. MTS assay_5
• 4. Determination of IC50 values_5
• 5. Target prediction using GalaxyWEB_6
• 6. Target screening using Open Targets platform_6
• 7. In silico docking_6
• 8. Statistical analysis_8
• Ⅲ. 결과
• 1. MTS assay_11
• 2. Differential cytotoxicity and IC50 of DK compounds_20
• 3. Target protein prediction and selection_22
• 4. In silico docking analysis_25
• Ⅳ. 결론 및 고찰_29
• 참 고 문 헌_31
• ABSTRACT_36