고약버섯속 배양액에서 분리한 2차 대사산물인 3,4,6-trihydroxy-2-methylbenzaldehyde의 생리활성 평가 = Evaluation of the biological activity of 3,4,6-trihydroxy-2-methylbenzaldehyde, a secondary metabolite isolated from the culture broth of Phanerochaete aff. ericina

국문 초록 (Abstract)

3,4,6-trihydroxy-2-methylbenzaldehyde (PE-1) 는 Phanerochaete aff. ericina라고 불리는 고약버섯의 배양액에서 분리된 2차 대사산물인 benzaldehyde 유도체이다. Phanerochaete는 백색부휴균(White rot fungus) 에 속하며 미생물이나 식물 등의 생존에 필수적이지 않지만 환경 적응 및 방어, 상호작용을 위해 생성하는 특수 대사산물인 2차 대사산물을 생성한다고 알려져 있다. 이는 다양한 생리활성을 가져 만성염증으로 인한 대사 질환, 신경계 질환, 심혈관계 질환, 암 등 여러 질병의 예방 및 치료를 위한 새로운 치료제 개발의 중요한 자원으로 간주된다. 염증이란 외부 자극이나 신체 손상에 대한 면역 반응이며, 조직 손상과 회복을 조절하는 중요한 생리적 반응이다. 그러나 과도한 면역 반응이 지속되어 만성 염증이 된다면 자가면역 질환, 심혈관 질환, 암, 당뇨병 등 다양한 질병의 발병에 기여할 수 있다. 특히, 제 2형 당뇨병으로 인한 고혈당 상태가 지속될 경우 만성 염증을 유발하는 악순환을 초래할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 마우스 대식세포주 RAW264.7와 흰쥐의 췌장 β-세포주 INS-1 세포에서 Phanerochaete aff. ericina 배양액에서 분리한 2차 대사산물인 PE-1의 염증 및 인슐린 분비 조절 능력을 확인하여 생리 활성을 평가하였다. 50 μM PE-1은 RAW264.7 및 INS-1 세포 증식을 대조군 대비 각각 115±2.56%, 224.5±17.97% 증가시켰다. PE-1은 대식세포주 RAW264.7에서 inhibitor of kappa B α (IκBα)와 nuclear factor-kappa B (NF-κB)의 활성화를 억제함으로써 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 단백질 발현과 nitric oxide (NO) 생성을 감소시켰다. 또한, PE-1 처리는 염증성 사이토카인인 interleukin-6 (IL-6) 및 tumor necrosis factor-α (TNF-α)의 생성을 감소시켰으며 cytokine array를 통해 intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)의 생성을 감소시켰다. PE-1은 소장에서 이당류를 포도당으로 분해하는 효소인 α-glucosidase 활성을 유의적으로 억제하여 α-glucosidase 억제제로 알려진 Acarbose와 유사한 기능을 나타내었다. PE-1 처리는 β-세포주 INS-1 세포에서 PI3K-AKT 신호전달 경로를 활성화하여 세포 내 Ca²⁺ 수준을 증가시킴으로써 인슐린 분비를 증가시켰다. 이러한 결과를 바탕으로 PE-1은 염증 반응과 인슐린 분비를 조절하는 이중 기능을 가지고 있으며, 이는 PE-1이 기능성 식품이나 치료제 개발을 위한 유망한 천연 화합물일 가능성이 있음을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

3,4,6-trihydroxy-2-methylbenzaldehyde (PE-1) is a natural compound, a secondary metabolite, isolated from the culture of the Phanerochaete aff. ericina. Phanerochaete belongs to the white rot fungus and is known to produce specialized secondary metabolites, which are not essential for the survival of microorganisms or plants but are produced for environmental adaptation, defense, and interaction. Because of its diverse physiological activities, PE-1 is considered a valuable resource for the development of novel therapeutics for the prevention and treatment of various diseases, including metabolic diseases, neurological diseases, cardiovascular diseases, and cancer, caused by chronic inflammation. Inflammation is an immune response to external stimuli or bodily damage, and is a crucial physiological response that regulates tissue damage and repair. However, if an excessive immune response persists and becomes chronic, it can contribute to the development of various diseases, including autoimmune diseases, cardiovascular diseases, cancer, and diabetes. In particular, persistent hyperglycemia due to type 2 diabetes can lead to a vicious cycle of chronic inflammation. In this study, we evaluated the physiological activity regulation of PE-1, a secondary metabolite isolated from the culture medium of Phanerochaete aff. ericina, by confirming its ability to regulate inflammation and insulin secretion in the mouse macrophage cell line RAW264.7 and the rat pancreatic β-cell line INS-1 cells. 50 μM PE-1 increased RAW264.7 and INS-1 cell proliferation by 15% and 124.5%, respectively. PE-1 reduced inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein expression and nitric oxide (NO) production by suppressing the activation of Inhibitor of kappa B α (IκBα) and Nuclear factor-kappa B (NF-κB) in the macrophage cell line RAW264.7. In addition, PE-1 treatment reduced the production of inflammatory cytokines, Interleukin-6 (IL-6) and Tumor necrosis factor-α (TNF-α), and reduced the production of Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) through cytokine array. PE-1 exhibited a function similar to that of type 2 diabetes treatment by inhibiting α-glucosidase activity, an enzyme that breaks down disaccharides into absorbable monosaccharides, glucose, in the intestine. PE-1 treatment increased insulin secretion by increasing intracellular Ca²⁺ levels through activating the PI3K-AKT signaling pathway in β-cell line INS-1 cells. Based on these results, PE-1 has a dual function of regulating inflammatory responses and insulin secretion, suggesting that PE-1 may be a promising natural compound for the development of functional foods or therapeutics.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 이론적 배경 3
• 1. 3,4,6-trihydroxy-2-methylbenzaldehyde (PE-1) 3
• 2. 염증 관련 연구동향 5
• 3. 인슐린 조절 관련 연구동향 6
• Ⅲ. 연구방법 및 내용 7
• 1. 실험 재료 7
• 2. PE-1이 염증 반응에 미치는 영향 9
• 2.1. RAW264.7 세포 배양 9
• 2.2. RAW264.7 세포 증식 측정 10
• 2.3. Nitric oxide (NO) 농도 측정 11
• 2.4. Intereukin-6 (IL-6) 및 Tumor necrosis factor-α (TNF-α) 농도 측정 12
• 2.5. Cytokine array 분석 13
• 2.6. Western blot 분석에 의한 염증 조절 관련 단백질 발현 평가 14
• 3. PE-1이 인슐린 분비 조절에 미치는 영향 15
• 3.1. α-glucosidase 저해 활성 평가 15
• 3.2. INS-1 세포 배양 16
• 3.3. INS-1 세포 증식 측정 17
• 3.4. 인슐린 분비능 평가 18
• 3.5. 세포 내 Ca2+ 수준 평가 19
• 3.6. Western blot 분석에 의한 인슐린 조절 관련 단백질 발현 평가 20
• 4. 통계 분석 21
• Ⅳ. 결과 및 고찰 22
• 1. PE-1이 대식 세포주 RAW264.7 세포 증식에 미치는 영향 22
• 2. PE-1의 iNOS 단백질 발현을 통한 NO 생성에 미치는 영향 24
• 3. PE-1이 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향 27
• 4. PE-1이 염증 조절 관련 유전자 발현에 미치는 영향 30
• 5. PE-1의 α-glucosidase 저해 활성에 미치는 영향 33
• 6. PE-1이 인슐린종 세포주 INS-1 세포 증식에 미치는 영향 35
• 7. PE-1이 INS-1 세포에서 인슐린 분비에 미치는 영향 37
• 8. PE-1이 Ca2+ 수준에 미치는 영향 39
• 9. PE-1이 인슐린 분비 증가 관련 유전자 발현에 미치는 영향 41
• Ⅴ. 결론 및 제언 43
• 참고문헌 45
• 영문초록 54