T 세포 관련 염증 반응 조절을 위한 신규 PP2A 작용제 개발 연구 = Development of Novel PP2A Modulators for Regulating T cell?Mediated Inflammatory Responses

국문 초록 (Abstract)

단백질 인산가수분해효소인 Protein Phosphatase 2A (PP2A)는 세린/트레오닌 잔기의 탈인산화를 통해 세포 성장, 분화, 생존 및 염증 조절 등 다양한 생리적 과정에 관여하며, NF-κB, MAPK, Akt 등 주요 염증 관련 신호경로를 탈인산화하여 염증 반응을 억제하는 음성 조절 인자로 알려져 있다. 본 연구에서는 PP2A 활성 증가 또는 억제가 Jurkat T 세포 염증 반응에 미치는 영향을 확인하기 위해, 이전 연구를 통해서 PP2A 활성제로 보고된 DT-061, FTY720, TRC382와 PP2A 억제제로 알려진 Okadaic acid를 활용하였다. 이 약물들을 이용해 Jurkat T 세포에서 PP2A 활성이 중요한 염증신호 중 하나인 NF-ĸB 신호전달경로 조절에 미치는 영향을 분석하였다. 여러 약물 농도 및 시간 조건에서 PP2A 활성도, IĸB 및 p65 단백질의 인산화 수준, NF-ĸB 전사 활성을 비교하였고 추가적으로 PP2A 활성에 따른 NF-ĸB 표적 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 변화를 분석하였다. PP2A 활성 분석 결과, DT-061과 FTY720은 PP2A 활성을 유의미하게 증가시켰고, Okadaic acid는 PP2A 활성을 억제하였다. 반면, 기존에 PP2A 활성제로 보고된 TRC382는 Jurkat T 세포에서 PP2A 활성을 억제하는 양상을 나타냈다. PP2A의 직접적 탈인산화 기질로 알려진 IĸB의 인산화 수준을 확인한 결과, PP2A 활성을 증가시킨 약물들은 IĸB 인산화가 감소하였고, PP2A 활성을 감소시킨 약물들은 IĸB 인산화가 증가하였다. PMA로 Jurkat T 세포에서 NF-ĸB 경로 자극한 조건에서도 PP2A 활성을 증가시킨 약물들은 NF-ĸB 경로 신호 인산화가 감소하는 경향이, PP2A 활성을 감소시킨 약물들은 NF- ĸB 경로 신호 단백질의 인산화가 증가되는 동일한 경향을 보였다. 이러한 결과는 PP2A가 Jurkat T 세포에서 NF-κB 경로의 중요한 음성 조절자로 작용함을 확인시켜 주었다. 또한 NF- ĸB luciferase reporter assay와 NF-ĸB 표적 염증성 사이토카인을 분석에서도 PP2A 활성이 증가할 때 전사 활성 및 염증성 사이토카인 발현이 일관되게 감소하는 결과를 얻었다. 위 연구의 결과는 PP2A 활성이 Jurkat T 세포의 NF-κB 매개 염증 반응에 직접적인 영향을 미친다는 것을 보여주며, PP2A 활성제인 FTY720과 DT-061은 Jurkat T 세포에서 IĸB를 탈인산화를 통해 NF-ĸB와 NF-ĸB 표적 유전자의 발현을 억제한다. 이는 PP2A 활성제가 염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료적 타깃으로서 이용될 가능성을 시사한다. 그러나 기존 PP2A 조절 약물들을 이용해 Jurkat T 세포에서 24시간 기준으로 세포독성 평가를 진행했을 때, 10 µM에서 50% 이상의 세포 독성을 보였으며, 특히 TRC382는 Jurkat T 세포에서 PP2A 억제제로 작용해 기대한 항염증 효과를 나타내지 못하였다. 이러한 한계점들을 극복하기 위해 본 연구에서는 구조적 변형을 통해 개발된 69종의 TRC 유도체를 확보하여, 이들 중 독성이 낮고 항염증 효과가 향상된 후보물질을 선별하였다. TRC 계열 화합물은 페노티아진 및 디벤자제핀 기반 구조를 바탕으로 개발된 SAMP (Small MolecμLar Activator PP2A)로, 이는 PP2A의 A 서브유닛에 결합하여 PP2A의 구조적 변화를 유도하는 작용기전을 가진다. 69개의 유도체를 분석한 결과 PP2A 활성 증가 효과가 우수하고 세포 독성이 낮은 15개의 활성제를 최종 선별하였다. 선정된 후보물질은 기존 약물 대비 낮은 세포 독성 (0-10%) 수준을 보였으며, NF-ĸB 경로 및 IkB 인산화 억제 측면에서도 개선된 항염증 효과를 보였다. 따라서 본 연구에서 도출된 15개의 TRC 유도체는 향후 염증 조절을 위한 새로운 PP2A 기반 치료제 개발에 유망한 선도 화합물로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• 국문 요약 ⅰ-ⅱ
• 차례 ⅲ-ⅳ
• 그림 목차 ⅴ-ⅵ
• 서론 1-13
• 실험 재료 및 연구방법 14-23
• 1. 실험 재료 14-15
• 2. 세포배양 16
• 3. 단백질 발현분석 (Western Blot) 16-18
• 4. 세포 생존율 평가 18-19
• 5. 약물 독성 평가 (LDH assay) 19
• 6. mRNA 발현 분석 (Real time PCR) 19-20
• 7. NF-ĸb 활성 분석 (Luciferase assay) 21-22
• 8. PP2A activity assay 22-23
• 9. 통계 분석 23
• 결과 24-32
• 1. Jurkat T 세포에서 PP2A 조절 약물 기본 반응 평가 24
• 2. Jurkat T 세포에서 PP2A 조절 약물에 따른 PP2A 직접 타겟 단백질 변화
• 25-26
• 3. Jurkat T 세포에서 PP2A 조절 약물에 따른 NF-κB 신호 변화와 사이토카인 발현
• 분석 27-29
• 4. Jurkat T 세포에서 PP2A 조절 약물의 독성 평가 확인 29-30
• 5. 기존 PP2A 조절 약물 결과를 바탕으로 Jurkat T세포에서 TRC 유도체 약물 선별
• 30-32
• 고찰 51-55
• 참고문헌 56-69
• Abstract 70-71