SMARCA4 결핍 미분화 종양 및 일부 소원형세포종양의 강력한 치료 표적으로서의 Delta-like Ligand 3 (DLL3) : DLL3 expression in SMARCA4-deficient undifferentiated tumor = Delta-like Ligand 3 (DLL3) as a Potent Therapeutic Target in SMARCA4-Deficient Undifferentiated Tumors and a Subset of Small Round Cell Tumors

국문 초록 (Abstract)

배경: 소원형세포종양(Small round cell tumors, SRTs)은 형태학적 특징이 서로 겹쳐 진단이 어렵고 치료 옵션이 제한적인 공격적인 악성 종양군이다. Delta-like ligand 3 (DLL3)는 정상 성인 조직에서는 거의 발현되지 않는 억제성 Notch 리간드로, 최근 신경내분비 종양의 유망한 치료 표적으로 부상했다. 그러나 광범위한 SRT에서의 DLL3 발현 빈도, 생물학적 의의 및 치료적 잠재력에 대해서는 아직 불완전하게 규명된 상태이다. 방법: 2017년부터 2023년 사이에 진단된 총 128례의 SRT 환자 검체를 포함하는 조직 미세 배열(Tissue Microarray)을 제작하여 DLL3 면역조직화학 염색을 시행했다. 연구 대상에는 포상 횡문근육종(16례), 결합조직형성 소원형세포종양(6례), 유잉육종(26례), 후각신경모세포종(25례), SMARCA4 결핍 미분화 종양(SMARCA4-dUT, 12례), SMARCB1 결핍 미분화 종양(1례), 활막육종(20례), 미분화 소원형세포육종(6례), NUT 암종(7례) 및 기타 희귀 종양이 포함되었다. DLL3 양성 판정은 임상적으로 유의한 두 가지 기준(종양 세포의 ≥1% 및 ≥5%)을 사용하여 평가했다. 추가적으로 DLL3 양성(H82, H661) 및 음성(BEAS-2B) 세포주를 이용하여 DLL3 표적 항체-약물 접합체인 Rovalpituzumab tesirine (Rova-T)의 효과를 확인하기 위한 웨스턴 블롯 및 세포 독성 분석을 수행했다. 결과: 전체 SRT의 14.1%(18/128례, ≥1% 기준)에서 DLL3 발현이 관찰되었으며, 특정 아형에서 뚜렷한 농축(enrichment)을 보였다. 특히 SMARCA4-dUT는 12례 중 6례(50%)에서 양성을 보여, 비(non)-SMARCA4-dUT 증례(10.3%)에 비해 통계적으로 매우 유의하게 높은 발현율을 나타냈다(p=0.001). DLL3 발현은 시냅토파이신(synaptophysin) 양성 소견과 유의한 연관성을 보였다(≥5% 기준, 77.8% vs 30.3%, p=0.011). 체외(In vitro) 검증 결과, DLL3 단백질이 강하게 발현된 H82 세포주는 Rova-T에 대해 매우 높은 민감도(IC50 = 0.8 nM)를 보인 반면, DLL3 음성 세포주는 완전한 저항성(IC50 >1000 nM)을 나타내어 1,000배 이상의 감수성 차이를 확인했다. 생존 분석 결과, DLL3 발현은 전체 생존율(OS)이나 무병 생존율(DFS)과는 상관관계가 없어(HR=1.04, p=0.94), DLL3가 예후(prognostic) 인자라기보다는 치료 반응 예측(predictive) 바이오마커로서의 성격을 띠는 것으로 나타났다. 결론: DLL3는 특정 SRT 아형, 그중에서도 매우 공격적인 SMARCA4-dUT에서 선택적으로 높게 발현된다. SMARCA4-dUT에서의 50%에 달하는 발현율과 신경내분비 표지자와의 유의한 연관성, 그리고 입증된 치료제 감수성은 즉각적인 임상 적용의 타당성을 뒷받침한다. 이러한 결과는 FDA 승인을 받은 이중 특이성 T세포 관여 항체(bispecific T-cell engager)인 tarlatamab과 같은 차세대 DLL3 표적 치료제의 바이오마커 기반 바구니형 임상시험(basket trials)에 SMARCA4-dUT 환자를 포함해야 함을 강력히 시사하며, 이는 치명적인 악성 종양 환자들에게 새로운 희망을 제시할 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Small round cell tumors (SRTs) comprise a heterogeneous group of aggressive malignancies characterized by overlapping morphological features, presenting significant diagnostic challenges and limited therapeutic options. Delta- like ligand 3 (DLL3), an inhibitory Notch ligand with restricted expression in normal adult tissues, has emerged as a promising therapeutic target in neuroendocrine tumors. However, its prevalence, biological significance, and therapeutic potential across the broader spectrum of SRTs remain incompletely characterized. Methods: We performed immunohistochemical analysis of DLL3 expression in a tissue microarray comprising 128 SRT cases diagnosed between 2017-2023, including alveolar rhabdomyosarcoma (n=16), desmoplastic small round cell tumor (n=6), Ewing sarcoma (n=26), olfactory neuroblastoma (n=25), SMARCA4- deficient undifferentiated tumor (SMARCA4-dUT, n=12), SMARCB1-deficient undifferentiated tumor (n=1), synovial sarcoma (n=20), undifferentiated small round cell sarcoma (n=6), NUT carcinoma (n=7), and other rare entities. DLL3 positivity was assessed using two clinically relevant cutoff values (≥1% and ≥5% of tumor cells). Additionally, we performed Western blot analysis and cytotoxicity assays using the DLL3-targeting antibody-drug conjugate Rovalpituzumab tesirine (Rova- T) in DLL3-positive (H82, H661) and DLL3-negative (BEAS-2B) cell lines. Results: DLL3 expression (≥1% cutoff) was observed in 18/128 (14.1%) of SRTs overall, with striking enrichment in specific subtypes. SMARCA4-dUTs demonstrated the highest prevalence with 6/12 (50%) cases positive, representing a highly significant enrichment compared to non-SMARCA4-dUT cases (50% vs 10.3%, p=0.001). DLL3 expression was significantly associated with synaptophysin positivity (77.8% vs 30.3%, p=0.011 at ≥5% cutoff). In vitro validation demonstrated robust DLL3 protein expression in H82 cells with corresponding exquisite sensitivity to Rova-T (IC50 = 0.8 nM), while DLL3-negative cells showed complete resistance (IC50 >1000 nM), confirming >1000-fold differential sensitivity. Survival analysis revealed that DLL3 expression did not correlate with overall survival (HR=1.04, p=0.94) or disease-free survival, positioning DLL3 as a predictive rather than prognostic biomarker. Conclusion: DLL3 is selectively expressed in specific SRT subtypes, with remarkable enrichment in the highly aggressive SMARCA4-dUTs. The 50% prevalence in SMARCA4-dUT, combined with the significant association with neuroendocrine markers and demonstrated therapeutic vulnerability, provides compelling rationale for immediate clinical translation. These findings strongly support the inclusion of SMARCA4-dUT patients in biomarker-driven basket trials of DLL3-targeted therapies, particularly next-generation agents like the FDA- approved bispecific T-cell engager tarlatamab, offering new hope for patients with these devastating malignancies.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of contents iii
• List of tables and figures iv
• Introduction 1
• Materials and Methods 3
• 1. Case selection 3
• 2. Tissue microarray (TMA) and Immunohistochemistry (IHC) 3
• 3. Cell culture 4
• 4. Cytotoxicity assay 4
• 5. Western blotting 4
• 6. DLL3 expression in a cell block from cell lines 5
• 7. Statistical Analysis 5
• Results 6
• 1. Patient Demographics and Tumor Characteristics 6
• 2. DLL3 Expression Patterns Across Tumor Types 6
• 3. Association with Neuroendocrine Markers 7
• 4. Association with PD-L1 Expression 13
• 5. DLL3 Expression and BRG-1 Status Validation 13
• 6. In Vitro Validation 14
• 7. Clinical Outcome Analysis 14
• Discussion 17
• Reference 19
• 국문요약 23
• List of tables and figures
• Table 1. Characteristics of small round cell tumor according to the DLL 3 expression 8
• Table 2. DLL3 expression in specifically SMARCA4-deficient undifferentiated tumor (SMARCA4-UT) 12
• Figure 1. Distinct immunohistochemical profiles of a SMARCA4-deficient undifferentiated tumor (SMARCA4-dUT) and an olfactory neuroblastoma 7
• Figure 2. Validation of DLL3 protein expression by Western blot and immunohistochemistry 13
• Figure 3. Cytotoxic effect of Rovalpituzumab Tesirine (Rova-T) on various cell lines 14
• Figure 4 Kaplan-Meier survival analysis based on DLL3 expression in the small round cell tumor (SRT) cohort 15