IER3IP1-Mediated ER-to-Golgi Trafficking Expands the Functional Landscape of the ER Membrane Complex = IER3IP1 의존적 ER-골지체 수송을 통한 ER 막 복합체의 기능적 범위 확장

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Membrane proteins are synthesized and targeted to the endoplasmic reticulum (ER), where their transmembrane domains (TMDs) are accurately inserted into the lipid bilayer. The proper folding and topology of membrane proteins are fundamental prerequisites for their functional maturation, and these processes are primarily governed by dedicated insertional machineries such as the translocon. Among these machineries, the ER membrane complex (EMC) has emerged as an insertase and molecular chaperone that primarily assists in the biogenesis of multi-pass membrane proteins. Although its contribution to membrane protein insertion is well established, the mechanisms by which EMC influences ER homeostasis and broader membrane trafficking processes remain to be elucidated.
To explore how EMC contributes to the maintenance of ER function, we sought to identify its client proteins that might illuminate downstream physiological roles. Using TurboID-based proximity labeling combined with quantitative mass spectrometry, we identified immediate early response3 interacting protein1 (IER3IP1) as an ER protein whose expression was markedly reduced under EMC-deficient conditions. Insertion assays demonstrated that EMC promotes membrane integration of IER3IP1’s TMD, and that the characteristically low hydrophobicity of this domain determines its dependence on EMC for proper insertion.
Given the previously reported role of IER3IP1 in modulating ER-to-Golgi trafficking, we further investigated its functional consequences using both fluorogenic and biochemical analyses through the Retention Using selective Hooks (RUSH) assay. Loss of IER3IP1 led to a pronounced delay in the Golgi transport of the secretory protein clusterin (CLU). Consistently, parallel defects in CLU trafficking were also observed in EMC-deficient cells, and this defect was rescued by re-expression of IER3IP1.
Additionally, crosslinking experiments revealed the presence of a small membrane- associated protein within the ER that specifically binds to the N-terminal TMD of IER3IP1. Mutational disruption of this region abolished complex formation, and notably, the pathogenic A18V mutation within this TMD not only disrupted the specific interaction but also impaired ER-to-Golgi transport of CLU.
Together, our findings demonstrate that IER3IP1 is inserted into the ER membrane via the EMC, forms a defined complex with a small membrane protein through its N-terminal TMD, and thereby modulates the kinetics of ER-to-Golgi trafficking. This work reveals a dual role for the EMC: first, to ensure the stable biogenesis of membrane proteins with marginally hydrophobic TMDs, and second, to maintain the fidelity of the secretory pathway through client-specific regulatory mechanisms. We propose that the EMC contributes to ER homeostasis by integrating its function in membrane protein biogenesis with the control of subsequent post-ER trafficking events.

국문 초록 (Abstract)

막단백질은 소포체에서 합성되며, 지질 이중층 내로 막관통영역이 정확히 삽입되는 과정을 거친다. 막단백질의 올바른 위상과 접힘은 기능적 성숙을 위한 필수 조건이며, 이 과정은 주로 translocon과 같은 삽입 장치에 의해 조절된다. 특히, ER membrane complex (EMC)는 다중 막관통영역을 가진 막단백질의 생합성을 돕는 insertase이자 분자 샤페론으로서 중요한 역할을 한다. EMC가 막단백질 삽입에 미치는 기능은 잘 알려져 있으나, 소포체 항상성 유지 및 단백질 수송 과정에서의 역할은 아직 명확히 밝혀지지 않았다.
본 연구에서는 EMC가 소포체 기능 유지에 기여하는 새로운 생리적 메커니즘을 규명하기 위해, EMC에 의해 삽입되는 막단백질을 탐색하였다. TurboID 기반 근접 바이오틴화와 정량적 질량분석을 활용한 결과, EMC 결핍 조건에서 발현이 현저히 감소하는 막단백질로 immediate early response 3 interacting protein 1(IER3IP1)을 확인하였다. 추가적으로, IER3IP1의 막관통영역은 낮은 소수성을 특징으로 하며, EMC의 도움 없이는 정상적으로 삽입되지 않음을 실험적으로 입증하였다.
IER3IP1이 소포체-골지체 단백질 수송에 관여한다는 선행 연구를 바탕으로, 형광 및 생화학적 분석을 포함한 RUSH(Retention Using Selective Hooks) 실험을 수행하였다. 그 결과, IER3IP1의 결핍은 분비단백질인 clusterin의 골지체 수송을 유의미하게 지연시켰으며, 이 현상은 EMC 결핍에서도 동일하게 관찰되었다. 또한, IER3IP1의 재발현을 통해 clusterin의 수송 속도가 회복됨을 확인하였다. 교차결합 실험을 통해 IER3IP1의 N-말단 막관통영역에 특이적으로 결합하는 소형 막단백질이 존재함을 밝혔으며, 해당 영역의 돌연변이가 복합체 형성과 소포체-골지체 수송 모두를 저해함을 확인하였습니다. 특히, 병원성 돌연변이인 A18V는 복합체 형성과 단백질 수송 모두에 결함을 유발하였다.
종합적으로, EMC는 IER3IP1의 막관통영역 삽입을 매개함으로써 안정적인 생합성을 보장하고, IER3IP1을 통해 소형 막단백질과 복합체를 형성함으로써 소포체-골지체 단백질 수송의 동역학을 조절하는 이중적 역할을 수행한다. 본 연구는 EMC가 소수성이 낮은 막관통영역을 가진 막단백질의 삽입뿐 아니라, 그 기질 단백질을 매개로 한 후속 단백질 수송 경로의 안정성 유지에도 기여함을 보여주며, EMC가 소포체 항상성 유지에 핵심적인 역할을 함을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i-ii
• Contents iii-iv
• List of Figures v-vii
• Introduction 1
• Material & Methods 7
• 1. Antibodies and reagents 7
• 2. Cell culture analyses 8
• 3. Molecular biology 10
• 4. Biochemistry 14
• 5. Quantitation and statistical analysis 16
• Results 17
• 1. ER-TurboID identifies IER3IP1 as an EMC clients 17
• 2. Insertion of IER3IP1 into the ER membrane is mediated by the EMC 19
• 3. EMC facilitates ER-to-Golgi trafficking of clusterin via IER3IP1 21
• 4. IER3IP1 forms a heteromer in the ER via its N-terminal TMD 23
• 5. A disease-causing mutation in the N-terminal TMD of IER3IP1 impairs clusterin secretion 25
• Figures and Legends 27
• Discussion 57
• References 64
• Summary in Korean 71