최적의 고환 오가노이드 기능 및 구조 확립을 위한 배양 시스템 연구 = Establishment of Functional and Structural Aspects of Porcine Testicular Organoid Culture System

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 2차원 배양에서 나타나는 평면적 구조 한계와 동물 실험의 윤리적 부담을 보완하고, 남성 생식 기전 연구와 독성 평가에 활용 가능한 3차원 모델을 제공하고자 하였다. 오가노이드 형성에 영향을 미치는 주요 공정 변수인 배양 용기, 배지 내 첨가제 조성, 배양 방식(부유 배양 vs. 공기–액체 경계면)의 비교·분석을 통해 생후 5일 신생자돈 유래 고환세포를 이용한 3차원 배양 시스템을 확립하였다. 3 mm 아가로스 몰드는 크기와 구조 모두에서 유리한 응집체를 보여주었고, KnockOut Serum Replacement를 포함한 배지는 관형 구조 형성에 중요한 역할을 하였다. 또한 공기-액체 경계면 방식으로 배양하는 것은 구조의 발달과 세포 기능 유지에서 필수적이었다.
최적화된 조건에서 오가노이드를 4주간 배양한 결과, 생체 고환의 핵심 특성의 모사를 확인하였다. 첫째, 정세관 유사 3차원 구조가 배양 3주차에 최대 수준으로 발달하였고 4주차까지 안정적으로 유지되었다. 둘째, 면역형광염색 결과 Sertoli 세포(SOX9/WT1+)가 생식세포(PGP9.5/GFRα1+)를 둘러싸는 조직학적 구획화가 뚜렷하게 재현됨을 확인하였다. 셋째, Sertoli 세포에서 미성숙 마커(AMH) 발현이 감소하고 성숙 마커(AR) 발현이 증가하는 등, 생체 내 발달 양상과 부합하는 성숙 단계를 시험관 내에서 구현하였다. 넷째, Leydig 세포가 외부 호르몬 자극(hCG/FSH)에 반응하여 스테로이드 합성 관련 핵심 유전자(CYP17A1) 발현이 유의하게 증가하였으며, 이에 따라 오가노이드가 기능적 내분비 반응성을 보유함을 입증하였다.
결론적으로, 돼지 고환 오가노이드 모델이 생체와 유사한 3차원 구조, 조직 특이적 세포 성숙, 내분비 기능 반응을 갖춘 고도화된 시험관 내 시스템임을 제시하였다. 본 모델은 향후 남성 불임의 병태생리 규명, 신약 및 환경 유해물질의 생식독성 평가, 정자형성 기전 연구를 위한 윤리적·실용적 전임상 플랫폼으로서 높은 활용 가치를 지닐 것으로 판단된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study established a three-dimensional (3D) model that can be used to study male reproductive mechanisms and evaluate toxicity, overcoming the limitations of the planar structure in two-dimensional (2D) culture and the ethical concerns of animal experiments. By optimizing key process variables—culture vessels, medium supplements, and culture methods (floating culture vs. air–liquid interface [ALI])—Testicular organoids was developed using cells from 5-day-old piglets. . The use of 3 mm agarose molds yielded aggregates with superior size and structural integrity, while the inclusion of KnockOut Serum Replacement was critical for forming distinct cord-like structures. Furthermore, culturing with an ALI method was essential for the development of the structure and the maintenance of cell function.
As a result of culturing organoids for 4 weeks under optimized conditions, the expression of core testicular characteristics was confirmed. Structurally, cord-like formations peaked at week 3 and remained stable through week 4. Immunofluorescence confirmed the precise compartmentalization of Germ cells (PGP9.5/GFRα1+) and Sertoli cells (SOX9/WT1+). Functionally, the maturation stage consistent with the developmental pattern in vivo—such as decreased expression of the immature marker (AMH) and increased expression of the mature marker (AR) in Sertoli cells—was achieved in vitro. Moreover, Leydig cells significantly increased the expression of a key gene (CYP17A1) related to steroid synthesis in response to external hormone stimulation (hCG/FSH).
In conclusion, this porcine testicular organoid model represents an advanced in vitro system that closely mimics the 3D architecture, tissue-specific maturation, and endocrine function of living tissue. This model is expected to have high utility as an ethical and practical preclinical platform for future pathophysiological investigations of male infertility, evaluation of reproductive toxicity of new drugs and environmental hazards, and studies on spermatogenesis mechanisms.

목차 (Table of Contents)

• 표목차 ⅳ
• 그림목차 ⅴ
• ABSTRACT ⅶ
• 제1장 서론 １
• 제1절 남성 불임 연구에서 3D 고환 오가노이드의 필요성 １
• 제2절 고환의 조직학적 특징과 오가노이드 평가 지표 １
• 제3절 기존 배양 전략과 한계 ３
• 제2장 연구방법 ６
• 제1절 고환 세포 분리 ６
• 제2절 고환 스페로이드와 오가노이드를 위한 주형 및 몰드 제작 ７
• 제3절 고환 스페로이드 및 오가노이드 배양 １０
• 1. 5일령 고환 스페로이드 배양 １０
• 2. 배양 용기별 비교 １０
• 3. 전배양 일수별 비교 １０
• 4. 혈청 조건별 비교 １０
• 5. 배양 방식별 비교 １１
• 6. 고환 오가노이드 장기 배양 １１
• 제4절 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색 １１
• 제5절 수용성 테트라졸륨 염-1 (Water-Soluble Tetrazolium, WST-1) 분석１２
• 제6절 RNA 추출, cDNA 합성, Polymerase Chain Reaction (PCR) 및 정량적 Quantitative PCR (qPCR) １２
• 제7절 젤라틴–아가로스 이중 포매 １６
• 제8절 면역형광(Immunofluorescence)분석 １６
• 제 9절 이미지 및 통계 분석 １７
• 제3장 결과 １８
• 제1절 배양 용기 및 전배양 조건이 오가노이드 형성에 미치는 영향 １８
• 1. 5일령 자돈 고환세포의 스페로이드 형성 능력 확인 １８
• 2. 배양 용기 종류에 따른 스페로이드 형성 및 오가노이드 발달 비교 ２０
• 3. 전배양 기간이 오가노이드 발달에 미치는 영향 ２３
• 제2절 배양 배지 내 Supplement 조건이 스페로이드 형성과 오가노이드 발달에 미치는 영향 ２５
• 1. Supplement 조건에 따른 스페로이드의 형태 및 응집도 비교 ２５
• 2. Supplement 조건에 따른 스페로이드의 세포 활성도 비교 ２８
• 3. Supplement 조건에 따른 스페로이드의 유전자 발현 ３０
• 4. Supplement 조건이 오가노이드의 조직학적 구조에 미치는 영향 ３３
• 제3절 배양 방식에 따른 오가노이드의 조직학적 구조 비교 ３５
• 1. 부유 배양(In-media) 방식의 조직학적 분석 한계 ３５
• 2. 젤라틴-아가로스 이중 포매를 통한 조직학적 분석법 최적화 ３７
• 3. 이중 포매 조건에 따른 조직 보존율 정량 분석 ４０
• 제4절 최적화 조건에서의 고환 오가노이드 장기 배양 및 기능 분석 ４３
• 1. 장기 배양에 따른 고환 오가노이드의 조직학적 변화 ４３
• 2. 장기 배양 오가노이드의 세포 특이적 유전자 발현 분석 ４６
• 3. 장기 배양 오가노이드의 세포 간 연접 유전자 발현 분석 ４９
• 4. 장기 배양 오가노이드의 면역형광염색을 통한 세포 분포 확인 ５２
• 제4장 고찰 ５５
• 제5장 결론 ５９
• 참고문헌 ６０
• 국문초록 ６８