서울시 하수에서 분리한 카바페넴 내성 시트로박터 프룬디균의 유전자적 특성 = Genetic Characteristics of Carbapenem-Resistant Citrobacter freundii Isolated from Wastewater in Seoul

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Carbapenem-resistant Enterobacterales (CRE) are an important group of multidrug-resistant bacteria that are resistant to several classes of antibiotics, including carbapenems, which are clinically used as last-resort antibiotics. Their persistence in the environment is recognized as a major driver of antimicrobial resistance dissemination. Accordingly, wastewater-based surveillance of resistant bacteria has been implemented in various countries and is being explored as a complementary approach to conventional clinical monitoring. In this study, carbapenem-resistant Citrobacter freundii (C. freundii) was isolated from municipal wastewater in Seoul, and its distribution patterns and genetic and phenotypic resistance characteristics were investigated to better understand the environmental presence and transmission potential of CRE. Between July 2023 and May 2024, 64 wastewater samples were collected and analyzed, resulting in the isolation of 41 carbapenem-resistant C. freundii strains. All isolates carried at least one carbapenemase gene, such as blaKPC, blaNDM, or blaVIM, with four strains harboring two or more of these genes. Most isolates possessed additional antimicrobial resistance genes, including those encoding broad-spectrum β-lactamases, and exhibited high-level resistance to multiple antibiotics. Molecular epidemiological analysis revealed genetically diverse lineages, indicating the coexistence of heterogeneous resistant strains within the wastewater. Plasmid profiling identified the IncX3 type, known as a major vector for carbapenemase gene dissemination, in 30 strains, most of which successfully transferred the plasmid via conjugation, demonstrating the potential for horizontal gene transfer in the wastewater environment. This study experimentally characterized the genetic features and transmission potential of wastewater-derived carbapenem-resistant C. freundii, providing foundational data on the environmental dissemination of AMR bacteria.

국문 초록 (Abstract)

카바페넴 내성 장내세균목(Carbapenem-resistant Enterobacterales, CRE)은 임상적으로 최후의 수단으로 쓰이는 항생제인 카바페넴뿐만 아니라 여러 계열 의 항생제에 내성을 보이는 중요한 다제내성균이다. 의료, 하수 환경에 남아 있을 경우, 항생제 내성 특성이 확산하는 위험 요인으로 인식되고 있다. 여 러 국가에서는 효율적인 내성균 감시를 위해 하수 및 환경 샘플을 활용한 내성균 감시 방안이 개발되고 있다. 본 연구에서는 서울시 하수에서 CRE Citrobacter freundii (C. freundii)를 분리하고, 분포 양상과 내성 관련 유전적· 표현형적 특성을 규명함으로써, 하수 환경 내 CRE의 특성과 확산 가능성을 정밀하게 이해하고자 하였다. 2023년 7월부터 2024년 5월까지 64건의 하수 샘플에서 CRE 의심 균주 1,451균주 중 총 41균주의 CRE C. freundii를 분리 하였다. 해당 균주는 blaKPC, blaNDM, blaVIM 등 하나 이상의 카바페넴 분해효소 유전자를 보유하고 있었으며, 이 중 4개의 균주는 두 종류 이상의 유전 자를 동시에 가지고 있었다. 대부분의 균주에서 광범위 베타락탐 분해효소 유전자를 포함한 다양한 항생제 내성 유전자가 검출되었고, 항생제 감수성 검사에서는 주요 항생제에 대한 고도의 내성 양상이 나타났다. 분자 역학적 분석 결과, 유전적 배경이 상이한 다양한 계통의 균주들이 확인되었으며, 이는 하수 내 내성균의 유전적 이질성을 시사한다. 특히, 플라스미드 분석에서 는 카바페넴 분해효소 유전자의 주요 전달체로 알려진 IncX3 유형이 30개의 균주에서 검출되었고, 이들 대부분 해당 플라스미드의 수평 전이가 확인되어 하수 내 내성 유전자의 확산 가능성을 뒷받침하였다. CRE C. freundii의 유전적 특성과 수평 전파 가능성을 실험적으로 규명하여, 환경 내 항생제 내성균의 특성과 확산 경로에 대한 기초 정보를 제공하였다.

목차 (Table of Contents)

• 표목차 ⅲ
• 그림목차 ⅳ
• ABSTRACT ⅴ
• 제1장 서론 1
• 제1절 항생제 사용 증가와 내성균의 확산 1
• 제2절 하수 감시를 이용한 항생제 내성균 감시 2
• 제3절 시트로박터 프룬디균의 특징과 항생제 내성 경향 2
• 제4절 연구의 필요성 및 목적 3
• 제2장 재료 및 방법 4
• 제1절 하수에서 항생제 내성균의 분리 및 동정 4
• 제2절 PCR을 이용한 항생제 내성 유전자 확인 6
• 1. 카바페넴 분해효소 유전자 6
• 2. 광범위 베타락탐 분해효소 유전자 6
• 3. 아미노글리코사이드 내성 유전자 7
• 4. 퀴놀론 내성 유전자 7
• 5. 콜리스틴 내성 유전자 7
• 제3절 플라스미드 유형 분석 8
• 제4절 항생제 감수성 시험 액체배지 미량 희석법 9
• 제5절 균주 간 유전적 유사성 분석 11
• 제6절 접합 12
• 제3장 실험 결과 13
• 제1절 C. freundii의 분리 및 동정 13
• 제2절 내성 유전자 분석 16
• 제3절 플라스미드 유형 분석 16
• 제4절 항생제 감수성 분석 20
• 제5절 균주 간 유전적 유사성 분석 23
• 제6절 플라스미드 전달능 분석 25
• 제4장 실험 고찰 29
• 제1절 C. freundii 감시체계의 필요성 29
• 제2절 항생제 내성 유전자와 임상적 시사점 30
• 제3절 항생제 내성 유전자의 전파 31
• 제5장 결론 32
• 참고문헌 33
• 부록 38
• [부록 1] ESBL primer sequences 38
• [부록 2] Aminoglycoside primer sequences 39
• [부록 3] PMQR primer sequences 40
• [부록 4] mcr primer sequences 41
• [부록 5] PBRT primer sequences 42
• 국문초록 43