돼지 족부 조직 유래 세포외기질이 돼지 정원줄기세포에 미치는 영향 : 복합 단백질을 활용한 배양 재료 탐색 연구 = Effect of porcine Foot Tissue-Derived Extracellular Matrix on Porcine Spermatogonial Stem Cells : Exploration of Composite Protein-Based Culture Materials

국문 초록 (Abstract)

세포외기질(extracellular matrix, ECM)은 생체 내 환경의 생화학적 및 구조적 특성을 모사함으로써 정원줄기세포(spermatogonia stem cell, SSC)의 기능을 지지한다. 그러나 돼지 정원줄기세포(porcine SSC, pSSC) 배양에서는 최적의 feeder cell 시스템과 ECM 재료의 부재가 여전히 중요한 제한 요인으로 남아 있다. 본 연구에서는 돼지 족부 조직으로부터 유래한 ECM(pECM)을 제작하여, 피더 의존적 조건에서 pSSC의 유지 및 증식을 지원하는 효율성을 평가하였다. pECM의 단백질 분자량 분포와 추출물의 조성을 분석하였으며, 주사전자현미경과 원자힘현미경을 이용하여 표면 특성을 관찰하였다. 또한 pECM을 젤라틴 코팅 및 비코팅 대조군(N/C)과 비교하여, 해당 배양 조건에서 SSC의 형태학적 분석, WST-1 분석, 세포주기 분석, 그리고 SSC 마커 유전자 및 단백질 발현을 평가하였다. 그 결과, pECM은 크기가 크고 형태가 뚜렷한 pSSC 콜로니의 형성을 촉진하였으며, PGP9.5, Thy-1, PLZF, GFRA1, NANOG, VASA 등 stemness 관련 마커의 발현을 증가시켰다. 또한 pECM은 pSSC의 활발한 증식을 유도하면서 피더의 과도한 증식을 억제하여, 안정적이고 기능적인 공배양 환경 조성에기여하였다. 반면, 젤라틴은 초기에 feeder 증식을 유도하였으나 성장 포화에 이르렀으며, N/C 조건에서는 세포 부착이 지연되고 생존율이 감소하였다. 이러한 결과는 pECM이 SSC의 생체 내 niche를 모사하여 pSSC 배양을 개선함을 시사한다. 또한 pECM이 feeder의 거동을 조절하고 pSSC의 유지능력을 강화하는 이중적 기능을 가짐으로써, 확립된 feeder-free 배양 체계가 부재한 종에서 유망한 생체재료로 활용될 수 있음을 보여준다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The extracellular matrix(ECM) supports spermatogonial stem cell(SSC) function by mimicking biochemical and structural features of the native niche. However, optimal feeder systems and ECM materials remain key limitations in porcine SSC(pSSC) cultures. We developed a porcine-derived ECM(pECM) from porcine feet and evaluated its effectiveness in supporting pSSC maintenance and proliferation under feeder-dependent conditions. We examined protein molecular weight distribution and pECM extract composition. Surface characterization was performed using scanning electron microscopy and atomic force microscopy. We compared pECM with conventional coatings, including gelatin and non-coated controls, using morphological analysis, WST-1 assay, cell cycle analysis, and gene/protein expression of SSC markers. pECM promoted larger, well-defined pSSC colonies and enhanced stemness-related marker expression, including PGP9.5, Thy-1, PLZF, GFRA1, NANOG, and VASA. Additionally, pECM facilitated active pSSC proliferation while suppressing feeder overgrowth, contributing to a stable and functional co-culture environment. Conversely, gelatin supported early feeder proliferation but led to growth saturation, whereas N/C showed delayed attachment and reduced viability. These findings suggest that pECM mimics the native SSC niche and improves pSSC culture. The dual function of pECM in regulating feeder behavior and enhancing pSSC maintenance highlights its potential as a biomaterial for species lacking established feeder-free protocols.

목차 (Table of Contents)

• 제 1 장 서론 １
• 제 2 장 재료 및 방법 ５
• 2.1 돼지 및 소의 족부 조직으로부터의 ECM 추출 ５
• 2.2. pECM 의 성분 및 단백질 분석 ６
• 2.3. porcine Testicular Total Cell 분리 ７
• 2.4. 다양한 코팅 환경에서의 pSSC 배양 ７
• 2.5. Scanning Electron Microscope 분석 １０
• 2.6. Atomic Force Microscope 분석 １０
• 2.7. WST-1 세포 생존율 분석 １１
• 2.8. 콜로니 계수 및 Alkaline Phosphatase 염색 １２
• 2.9. Immunocytochemistry 분석 １２
• 2.10. 콜로니 및 pFeeder 분리 １３
• 2.11. 세포주기 분석 １３
• 2.12. 총 RNA 추출 및 RT-PCR, qPCR １４
• 2.13. Western blotting １７
• 2.14. 통계 분석 １８
• 제 3 장 결과 １９
• 3.1 pECM 의 분자량 분포 및 조성 １９
• 3.2 코팅 재료의 표면 거칠기 ２１
• 3.3. 서로 다른 코팅 조건에서의 세포 형태, 증식의 비교 ２３
• 3.4 콜로니의 AP 활성 비교 및 ICC 를 통한 콜로니 특성화 ２８
• 3.5 pSSC 콜로니와 pFeeder 의 세포주기 분석 ３０
• 3.6 7 일차 콜로니의 유전자 및 단백질 발현 분석 ３５
• 3.7. 13 일차 콜로니의 유전자 및 단백질 발현 분석 ３７
• 제 4 장 고찰 ３９
• 4.1. SSC 배양 시스템에서 pECM 의 의의 ３９
• 4.2. pSSC 배양을 위한 미세환경적 특성 ４１
• 4.3 pECM 에 의한 pSSC 및 피더 세포의 세포역학 조절 ４３
• 4.4 pECM 에 의한 SSC 관련 마커 조절 ４５
• 4.5 pECM 의 추가 응용 가능성 ４７
• 4.6 연구의 한계점 ４９
• 제 5 장 결론 ５１
• 참고문헌 ５２
• 국문초록 ６4