INO80 regulates promoter-associated R- loops to coordinate transcription and maintain genome stability in embryonic stem cells : Revealing a stabilizing role of INO80 in physiological R-loop homeostasis = INO80은 배아줄기세포에서 전사 조절과 게놈 안정성 유지를 위해 프로모터 연관 R-루프를 조절한다 : 생리적 R-루프 항상성 유지에서 INO80의 안정화 역할 규명

국문 초록 (Abstract)

배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)는 전사(transcription)와 DNA 복제가 정밀하게 조정되어야 하는 독특한 세포주기 구조와 염색질 특성을 지닌다.
염색질 재구성 인자인 INO80은 전사와 게놈 안정성 조절에 관여하는 것으로 알려져 있으나, ESC에서의 R-loop 항상성 유지에 대한 역할은 아직 명확히 규명되지 않았다. R-loop는 RNA–DNA 하이브리드로 형성되는 3가닥 구조로, 전사 조절에 기능하지만 적절히 조절되지 않을 경우 복제 스트레스와 게놈 불안정을 유발할 수 있다.
본 연구에서는 마우스 ESC에서 INO80 결손이 R-loop 역학, 복제 스트레스 반응, 그리고 전사 조절에 미치는 영향을 조사하였다. INO80이 결핍된 세포 는 정상 조건에서 R-loop의 전반적인 감소를 보였으며, 특히 다능성 관련 전사인자가 풍부한 프로모터 영역에서의 감소가 두드러졌다. 반면, 하이드 록시우레아(hydroxyurea, HU)에 의해 복제 스트레스가 유도된 조건에서는 Rloop 수준이 회복되어, INO80이 스트레스 유도 R-loop 축적에는 필수적이지 않지만 생리적 조건에서의 R-loop 유지에는 필요함을 시사하였다. CUT&Tag 및 ChIP-seq 분석 결과, 여러 R-loop 영역이 INO80 결합 부위와 중첩되며 전사 활성화 및 게놈 유지와 연관되어 있음을 확인하였다. 또한 전사체 분석을 통해 INO80 의존적 R-loop는 세포주기 진행, DNA 복구, 염색질 조직화에 관여하는 유전자들과 관련되어 있음을 확인하였으며, INO80 결손은 전사프로그램의 변화, G1기 정지, 그리고 세포사멸 증가를 초래하였다. 이러한 결과는 INO80이 기능적 R-loop를 안정화하여 전사 조절과 게놈 안정성을 동시에 유지함을 의미한다.
결론적으로, 본 연구는 ESC에서 INO80이 생리적 R-loop 항상성을 유지하는 데 핵심적인 역할을 수행함을 새롭게 규명하였다. INO80은 프로모터 연관R-loop를 안정화하고 전사와 세포주기 진행을 조정함으로써 전사 조절 및 게놈 안정성을 보존한다. 이러한 결과는 염색질 재구성이 R-loop 항상성 유지에 필수적임을 보여주며, INO80의 기능 이상이 줄기세포의 정체성과 게놈
안정성에 중대한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

INO80 regulates promoter-associated R-loops to coordinate transcription and maintain genome stability in embryonic stem cells Revealing a stabilizing role of INO80 in physiological R-loop homeostasis Lim Hoseong Department of Stem cell and Regenerative biotechnology Graduate School of Konkuk University Embryonic stem cells (ESCs) possess a distinctive cell cycle structure and chromatin landscape that necessitate precise coordination between transcription and DNA replication. The chromatin remodeler INO80 regulates both transcription and genome stability; however, its role in R-loop homeostasis in ESCs remains incompletely understood. R-loops, which are formed by RNA–DNA hybrids, play regulatory roles but can also induce replication stress and genomic instability if unregulated. We investigated the effects of INO80 loss on R-loop dynamics, replication stress responses, and transcriptional regulation in mouse ESCs. INO80-deficient cells exhibited a global reduction in steady-state R-loops under normal conditions, with the most pronounced loss at promoters enriched for pluripotency-associated transcription factors. R-loop levels were restored under hydroxyurea-induced replication stress, indicating that INO80 is dispensable for stress-induced R-loop accumulation but is required for maintaining physiological R-loops. Cleavage Under Targets and Tagmentation and chromatin immunoprecipitation sequencing revealed that several R- loop regions overlap with INO80-binding sites and are linked to transcriptional activation and genome maintenance. Transcriptome analysis showed that INO80- stabilized R-loops are associated with genes involved in cell cycle progression, DNA repair, and chromatin organization, whereas INO80 loss results in altered transcriptional programs, G1 arrest, and increased apoptosis. These findings indicate that INO80 stabilizes functional R-loops that support transcriptional regulation and genomic integrity. Our study identifies a previously unrecognized role for INO80 in preserving functional R-loops in ESCs. By stabilizing promoter-associated R-loops and coordinating transcription during cell cycle progression, INO80 maintains both transcriptional regulation and genome stability. These findings underscore the importance of chromatin remodeling in maintaining R-loop homeostasis and suggest that INO80 dysfunction may have implications for stem cell identity and genomic integrity. Keyword: INO80, embryonic stem cells, R-loop homeostasis, chromatin remodeling, transcription- replication conflict

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Material and methods 4
• 2.1. Cell culture 4
• 2.2. DNA:RNA hybrid quantification 4
• 2.3. Analyses of cell proliferation, cell cycle, and apoptosis 5
• 2.4. Immunofluorescence 5
• 2.5. R-loop CUT&Tag and downstream data analyses 5
• 2.6. Public data analysis 7
• 2.7. Functional enrichment analysis 7
• 2.8. Transcription factor motif enrichment analysis 7
• 2.9. Statistical analysis 8
• Ⅲ. Results 9
• 3.1. INO80 deficiency sensitizes ESCs to replication stress and disrupts cell cycle progression 9
• 3.2 INO80 iKO causes significant loss of physiological R- Loops 11
• 3.3. INO80 deletion leads to a global reduction of R-loops, particularly at promoters enriched for pluripotency-associated motifs 14
• 3.4. Context-dependent regulation of R-loops by INO80 links chromatin remodeling to transcriptional control in ESCs 18
• 3.5. Transcriptomic consequences of INO80 loss at promoter-associated R-loop regions 22
• Ⅳ. Discussion 25
• Ⅴ. Conclusion 30
• References 31
• Abstract (in Korean) 40