Fukinolic Acid Amplifies β-Amyloid-Induced Neurotoxicity = 푸키놀릭산의 베타 아밀로이드 매개 신경독성 증폭 효과

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by β-amyloid (Aβ) aggregation, synaptic dysfunction, and cognitive decline. Although natural polyphenols are widely recognized for their antioxidant and anti-aggregation properties, their specific effects on Aβ pathology remain incompletely understood. In this study, we investigated the molecular, cellular, and in vivo effects of fukinolic acid (FA)—a phenolic compound derived from Petasites japonicus—on Aβ1-42 aggregation and neurotoxicity. Aβ1-42 aggregation was evaluated using in silico docking simulation, Thioflavin T fluorescence assay, and photo-induced cross-linking (PICUP) western blot. Synaptic function was assessed through field potential recordings in acute hippocampal slices, while cell viability (MTT, LDH) and NMDAR inhibition experiments were performed in Neuro2a cells. In vivo, 5XFAD transgenic mice were orally administered FA (30 mg/kg/day, 4 weeks), followed by immunohistochemical analyses (ThS, 4G8, NeuN, TUNEL, Iba-1) and Y-maze behavioral testing. Docking results revealed stable interactions between FA and Aβ₁–₄₂ via hydrogen bonding (Asp7, His14) and π–π stacking (Tyr10), suggesting potential modulation of aggregation dynamics. FA inhibited fibril formation but promoted accumulation of high- molecular-weight oligomers, the most neurotoxic Aβ species. In Neuro2a cells, FA alone was not cytotoxic; however, co-treatment with Aβ significantly enhanced cell death through an NMDAR-dependent pathway. In hippocampal slices, FA treatment suppressed long-term potentiation (LTP) without affecting basal synaptic transmission. In 5XFAD mice, chronic FA administration increased Aβ plaque burden, neuronal apoptosis, microglial activation, and working-memory impairment. In conclusion, despite its expected antioxidant properties, FA exacerbated Aβ-induced neurotoxicity by shifting aggregation toward toxic oligomeric intermediates and amplifying excitotoxic and inflammatory signaling. These findings indicate that certain natural polyphenols can act as context-dependent pro-pathogenic modulators in Alzheimer’s disease, highlighting the need for cautious evaluation of their dose- dependent effects in neurodegenerative models.

국문 초록 (Abstract)

알츠하이머병(Alzheimer’s disease, AD)은 β-아밀로이드(Aβ) 단백질의 응집, 시냅스 기능 저하 및 인지 기능의 손실을 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 질환이다. 천연 폴리페놀 화합물은 일반적으로 항산화 및 단백질 응집 억제 작용을 통해 신경 보호 효과를 보이는 것으로 알려져 있으나, Aβ 병리에 미치는 구체적인 영향은 명확히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 머위(Petasites japonicus)로부터 유래한 페놀성 화합물인 fukinolic acid (FA)가 Aβ1-42의 응집 및 신경독성에 미치는 영향을 분자, 세포, 조직, 그리고 생체 수준에서 종합적으로 분석하였다. Aβ1-42의 응집 특성은 분자동역학 도킹 시뮬레이션(in silico docking simulation), Thioflavin T 형광 분석(ThT assay), 광유도 단백질 교차결합(PICUP) western blot을 통해 평가하였다. 시냅스 기능은 생쥐 해마 절편 전기생리학적 기록(field potential recording)으로 분석하였으며, 세포 생존율(MTT, LDH 분석) 및 NMDA 수용체 억제 실험은 Neuro2a 세포에서 수행하였다. 또한 5XFAD 형질전환 마우스에 FA(30 mg/kg/day)를 4주간 경구 투여한 뒤, 면역조직화학(ThS, 4G8, NeuN, TUNEL, Iba-1 염색) 및 Y미로 행동시험을 실시하였다. 그 결과, 도킹 분석에서는 FA가 Aβ1-42의 Asp7, His14 잔기와 수소결합을, Tyr10과 π–π stacking 상호작용을 형성함으로써 응집 경로에 관여할 가능성이 확인되었다. FA는 섬유 형성(fibrilization)을 억제하였으나, 고분자량 독성 올리고머의 축적을 증가시켰다. Neuro2a 세포에서 FA 단독 처리는 독성을 유발하지 않았으나, Aβ와 병용 처리 시 NMDA 수용체 의존적 경로를 통해 세포사멸이 현저히 증가하였다. 해마 절편에서도 FA는 장기강화(LTP) 유도를 억제하였으며, 5XFAD 마우스에서는 Aβ 플라크 및 신경세포 사멸, 미세아교세포 활성, 작업기억 손상이 모두 악화되었다. 결론적으로, FA는 예상된 항산화 효과와 달리 Aβ 유도 신경독성을 증폭시켜 병리적 응집을 독성 올리고머 경로로 전환시키고, 흥분독성 및 염증 반응을 강화시켰다. 본 연구는 일부 천연 폴리페놀이 상황 의존적 병리 조절 인자로 작용할 수 있음을 제시하며, 신경퇴행성 질환 연구에서 이들의 농도 의존적 및 산화-환원 반응 특성에 대한 신중한 평가의 필요성을 강조
한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• 1.1. Overview of Alzheimer’s disease 1
• 1.2. Pathological significance of Aβ1-42 2
• 1.3. Current therapeutic approaches and their limitations 3
• 1.4. Contribution of extrinsic factors to Aβ pathology 5
• 1.5. Overview of Fukinolic Acid 6
• Ⅱ. Materials and Methods 9
• Ⅲ. Results 13
• 3.1. FA reduced Aβ fibril but increased oligomer formation 13
• 3.1.1. In silico molecular docking simulation 13
• 3.1.2. FA reduced Aβ fibrils 15
• 3.1.3. FA increased high molecular weight oligomer of Aβ 17
• 3.2. FA increased synaptotoxicity 19
• 3.2.1. Effect of FA on basal synaptic functions 19
• 3.2.2. Effect of FA on long-term synaptic plasticity 21
• 3.3. FA increased neurotoxicity of Aβ 23
• 3.3.1. Aβ induced neurotoxicity 23
• 3.3.2. FA induced mild neurotoxicity 25
• 3.3.3. FA synergistically increased Aβ-neurotoxicity 27
• 3.4. FA-increased Aβ neurotoxicity is NMDAR dependent 29
• 3.5. FA increased Aβ plaque in 5XFAD mice 31
• 3.6. FA increased neurodegeneration in 5XFAD mice 35
• 3.7. FA increased neuroinflammation in 5XFAD mice 38
• Ⅳ. Conclusion and Discussion 42
• References 46
• Abstract (in Korean) 51