DNA 친화 포획 분석법을 통한 Cupriavidus necator H16 신규 조절인자 MraZ 발굴 및 기능 연구 = Identification and Characterization of the Novel Regulator MraZ in Cupriavidus necator H16 Using DNA Affinity Capture Assay

국문 초록 (Abstract)

Cupriavidus necator는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 생산을 위한 미생물 플랫폼으로, 성능을 향상시키기 위해 수많은 대사 공학 전략이 적용되고 있다. 그러나 전사 조절 인자가 C. necator에서 전체 유전자의 약 12%를 구성하고 있지만, PHB 합성을 향상시키기 위해 전사 조절자를 활용하는 연구는 여전히 제한적이다. 이러한 격차를 해소하기 위해 본 연구에서는 phaR 기반 DNA 친화성 포획 분석법(DACA)을 사용하여 PHA 생산에 관여하는 전사 조절자를 체계적으로 검색했다. 이 분석을 통해 Cupriavidus necator의 이전에는 특성화되지 않았던 유전자 mraZ가 PHB 생합성과 관련된 후보 조절자로 확인되었다.
생리적 및 대사적 변화를 평가하기 위해 mraZ가 제거된 균주를 구성했다. qRT-PCR은 ftsZ와 PHA 생합성 유전자의 상향 조절된 발현과 다양한 배양 조건에서 돌연변이체 내 약 20% 더 높은 세포 성장 및 PHA 축적을 밝혀냈다. 동시에 스캔 및 투과 전자 현미경으로 확인된 바와 같이 세포 길이는 야생형보다 5배 이상 감소했다. 세포 크기가 작을수록 표면 대 부피 비율이 증가하고 당 이용 효율이 향상되었지만, PHB의 분자량이나 기계적 특성은 변하지 않았다. 이러한 발견은 mraZ와 같은 상류 조절 인자를 표적으로 삼는 것의 가치를 강조하고, PHB 생산과 관련하여 감소된 세포 크기의 중요성에 대한 새로운 통찰을 제공한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cupriavidus necator is a well-established microbial platform for polyhydroxyalkanoate (PHA) production and numerous metabolic engineering strategies have been applied to improve its performance. However, researches that utilize transcriptional regulators to enhance PHB synthesis remains limited. In particular, the upstream regulatory factors that control PHB biosynthesis have not been clearly identified. To address this gap, this study employed a phaR-based DNA affinity capture assay (DACA) to systematically search for transcriptional regulators involved in PHA production. Through this analysis, the previously uncharacterized gene in Cupriavidus necator, mraZ was identified as a candidate regulator associated with PHB biosynthesis.
We constructed an mraZ-deleted strain to assess the physiological and metabolic changes. qRT-PCR revealed the upregulated expression of ftsZ and PHA biosynthesis genes, along with ~20% higher cell growth and PHA accumulation in the mutant across various culture conditions. Simultaneously, the cell length was reduced by >5 times that of the wild type, as confirmed by scanning and transmission electron microscopy. Although the smaller cell size increased the surface-to-volume ratio and enhanced the sugar utilization efficiency, it did not alter the molecular weight or mechanical properties of PHB. These findings highlight the value of targeting upstream regulators such as mraZ and provide new insights into the significance of reduced cell size in relation to PHB production. Considering that regulators constitute ~12% of all genes in C. necator, Our results highlight the untapped potential of regulator-based molecular engineering for optimizing PHA production.

목차 (Table of Contents)

• 표 목 차 ⅲ
• 그림목차 ⅳ
• 국문초록 ⅴ
• 제1장 서론 1
• 제2장 실험 재료 및 방법 6
• 1. 미생물 배양 조건 및 deletion 균주 구축 6
• 2. 세포 성장 및 PHB 생합성 관련 유전자들의 전사 수준 분석 6
• 3. 세포막 인지질 지방산(PLFA) 조성을 확인하기 위한 단순화된 에스터 결합 지방산 분석(Simplified Ester-Linked Fatty Acid, ELFA) 7
• 4. 세포 크기 분석을 위한 주사전자현미경(SEM) 및 투과전자현미경(TEM) 관찰 7
• 5. PHA 분석 8
• 6. PHA 필름의 물리적, 열적 특성 분석 9
• 제3장 연구 결과 및 분석 11
• 제1절 PHA 생산에 관여하는 새로운 regulator 발굴 11
• 1. DACA를 이용한 phaR에 관여하는 새로운 regulator 발굴 11
• 2. 새로운 regulator인 mraZ 발굴 및 deletion 균주 구축 11
• 제2절 mraZ 유전자 결손에 따른 영향 확인 14
• 1. H16ΔmraZ mutant의 qRT-PCR 및 PLFA 분석을 이용한 특성 분석 14
• 2. mraZ 유전자에 따른 세포 성장 비교 17
• 3. mraZ 유전자에 따른 세포 크기 비교 22
• 4. 시간에 따른 세포 성장 비교 28
• 제3절 mraZ 유전자 결손에 따른 영향 확인 및 해석 31
• 1. mraZ 유전자 결손에 따른 PHA의 물리적 및 열적 특성 차이 확인 31
• 2. 전반적인 해석 및 시사점 33
• 제4장 결론 35
• 참고문헌 36
• ABSTRACT 40