Comparative Metabolomic Analysis of Lettuce Treated with Natural Triketone Compounds and Their Analogue = 천연 트라이케톤 화합물 및 유도체 처리에 따른 상추 대사체 비교 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Weeds are major factors that reduce crop productivity, and the use of effective herbicides is essential for maintaining stable agricultural production. Among herbicides, inhibitors of 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) constitute an important class with broad-spectrum herbicidal activity. Inhibition of HPPD suppresses carotenoid biosynthesis in plants, leading to chloroplast bleaching. However, concerns regarding resistance development caused by repeated applications of synthetic herbicides and their environmental persistence have increased the demand for safer, biodegradable herbicides derived from natural products. In particular, allelopathic plant metabolites with β- triketone structures, such as leptospermone, have been highlighted as natural HPPD inhibitors. In this study, natural β-triketone compounds (leptospermone, grandiflorone, and 4F-grandiflorone) and the synthetic HPPD inhibitor mesotrione were applied to lettuce (Lactuca sativa) to compare physiological and metabolic responses under pre- and post-emergence treatment conditions. Visual phenotype analysis showed that all four compounds induced bleaching, with stronger bleaching observed in pre-emergence treatments, consistent with previous reports indicating that early seedling stages are highly sensitive to HPPD inhibition. In the duckweed (Spirodela polyrhiza) assay, co-treatment with homogentisate (HGA) resulted in bleaching recovery only in mesotrione-treated plants, whereas the three natural β-triketones did not exhibit such recovery. This suggests that mesotrione may act at a specific step within the HPPD pathway that directly responds to HGA supplementation, while natural triketones may induce additional stress responses or metabolic disturbances beyond HPPD inhibition. In the GC-MS/MS-based metabolomic analysis, the affected pathways and the metabolites selected as biomarkers differed depending on the treatment compound. In the pre-emergence treatment, glyoxylate and dicarboxylate metabolism was significantly influenced by leptospermone and mesotrione, while metabolites such as sedoheptulose in the Calvin cycle were affected in the grandiflorone and 4F-grandiflorone treatments. In the post-emergence treatment as well, certain pathways, including pantothenate and CoA biosynthesis, exhibited distinct increasing or decreasing trends in metabolites depending on the compound applied. Overall, although the four β-triketone compounds commonly induced bleaching, their underlying metabolic and physiological mechanisms were not identical. Notably, the natural compounds and the synthetic herbicide mesotrione showed distinct metabolite-level responses despite structural similarity. This study provides metabolomic evidence for understanding the modes of action of natural triketone compounds and offers insights for the development of natural-product-based herbicides.

국문 초록 (Abstract)

잡초는 작물 생산성을 저해하는 주요 요인으로, 효과적인 제초제 활용은 안정적인 농업 생산성을 유지하는 데 필수적이다. 이 가운데 HPPD(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase) 저해제는 광범위한 제초 활성을 지닌 주요 제초제 계열로, 식물체 내에서 HPPD가 저해되면 카로티노이드 생합성이 억제되어 엽록체 백화 증상이 나타난다. 그러나 합성 제초제의 반복적 사용으로 인한 내성 문제와 환경 잔류성에 대한 우려가 커짐에 따라, 천연물 기반의 안전하고 생분해되는 제초제 개발에 대한 필요성이 증가하고 있다. 그 중 β-트리케톤 구조를 지닌 leptospermone과 같은 식물의 알레로파시 물질이 천연 HPPD 저해제로 주목받고 있다. 본 연구에서는 천연 β-트리케톤 화합물(leptospermone, grandiflorone, 4F-grandiflorone)과 합성 HPPD 저해제인 mesotrione을 상추(Lactuca sativa)에 처리하여, 발아 전·후 조건에서 나타나는 생리적 및 대사적 변화를 비교하였다. 시각적 표현형 분석 결과, 네 가지 물질 모두 백화 증상을 유도하였으며, 특히 발아 전 처리에서 더욱 강한 백화가 나타나 초기 유묘 단계가 HPPD 저해에 민감하다는 기존 보고와 일치하였다. 개구리밥(Spirodela polyrhiza) 실험에서 호모겐티스산 동시 처리 시 mesotrione 처리구에서만 백화 회복이 나타났고, 세 가지 천연 β-트리케톤에서는 회복이 관찰되지 않았다. 이는 mesotrione이 HPPD 경로 내 특정 단계에 직접 작용하는 반면, 천연 트리케톤들은 HPPD 저해와 더불어 추가적인 스트레스 반응 또는 대사 교란을 유도했을 가능성을 보여준다. GC–MS/MS 기반 대사체 분석 결과, 처리 물질에 따라 영향을 받은 경로와 바이오마커로 선정된 물질들의 차이가 존재했다. 발아 전 처리에 대해 글리옥실산 및 디카복실산 대사에서는 leptospermone과 mesotrione에 대해서 유의한 영향이 나타났으며, 칼빈회로에서는 grandiflorone과 4F-grandiflorone에서 sedoheptulose와 같은 대사물이 영향을 받은것으로 나타났다. 발아 후 처리에 대해서도 판토텐산과 CoA 합성 경로와 같은 일부 경로에서 처리 물질에 따른 대사물의 증감 경향이 다르게 나타났다.
종합적으로, 네 가지 β-트리케톤 화합물은 공통적으로 백화를 유도하지만 그 기저 대사적·생리적 기작은 동일하지 않았다. 특히 천연 화합물과 합성 제초제 mesotrione는 구조적 유사성에도 불구하고 대사체 수준에서 상이한 반응을 보였다. 본 연구는 천연 트리케톤 계열 화합물의 작용 기작 이해를 위한 대사체학적 근거를 제공하며, 향후 천연물 기반 제초제 개발에 중요한 방향성을 제시한다

목차 (Table of Contents)

• List of Tables ⅳ
• List of Figures Ⅴ
• ABSTRACT ⅷ
• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and methods 7
• 2.1. Chemicals and reagents 7
• 2.2. Purification and analysis of Manuka oil· 7
• 2.2.1 Silica column chromatography 7
• 2.2.2 Acid-base partitioning 8
• 2.3. Molecular Docking Analysis 8
• 2.4. Synthesis process of triketone compound 9
• 2.5. In vitro biassay 12
• 2.5.1. Plant material and growth conditions 12
• 2.5.2 Preparation of test solution 12
• 2.5.3. EC50 finding test 13
• 2.5.4 Calculation of germination rate 13
• 2.5.5 Pigment absorbance measurement 13
• 2.6. Definitive test: experimental design and compound treatment procedures pre-emergence treatment 14
• 2.7. Evaluation of HPPD inhibition and pigment bleaching in Spirodela polyrhiza· 15
• 2.8. Metabolic analysis 16
• 2.8.1. Primary metabolite extraction 16
• 2.8.2. GC-MS/MS analysis 17
• 2.8.3. Statistical Analysis 18
• Ⅲ. Results and Discussion 19
• 3.1. Purification and GC-MS analysis of Manuka oil 19
• 3.1.1. Silica gel column chromatography 19
• 3.1.2. Acid-base partitioning· 20
• 3.2. Docking analysis· 20
• 3.3. Synthesis result 22
• 3.4. In vitro assay 23
• 3.4.1. EC50 range test 23
• 3.4.2. Germination rate 28
• 3.4.3. Seedling length responses under pre- and post-emergence treatment conditions 30
• 3.4.4. UV spectrometer 32
• 3.5. Determination of Final Treatment Concentrations 33
• 3.6. Evaluation of HPPD inhibition and pigment bleaching in Spirodela polyrhiza 36
• 3.7. PCA analysis 38
• 3.7.1. Pre-emergence treatment 38
• 3.7.2. Post-emergence treatment 42
• 3.8. PLS-DA analysis 46
• 3.8.1. Pre-emergence treatment 46
• 3.8.2. Post-emergence treatment 50
• 3.9. Hierarchical clustering analysis (HCA) 55
• 3.9.1. Pre-emergence treatment 55
• 3.9.2. Post-emergence treatment 60
• 3.10. Pathway analysis 65
• 3.10.1. Pre-emergence treatment 65
• 3.10.2. Post-emergence treatment 72
• Ⅳ. Conclusion 77
• References 80
• Appendix 84
• Abstract (in Korean) 129