Anti-inflammatory and Gut-protective Effects of Probiotic Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi = 김치 유래 프로바이오틱 유산균의 항염 및 장 보호 효과

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Probiotics are beneficial microorganisms that play a crucial role in maintaining host health, particularly in the gastrointestinal system. They contribute to the modulation of immune responses, support the structural integrity of the intestinal epithelium, and enhance gut motility. However, gastrointestinal homeostasis can be easily disrupted by various factors such as poor dietary habits, psychological stress, and medication use. Among these, oxidative stress is considered one of the primary pathological factors contributing to intestinal damage. Excessive accumulation of reactive oxygen species (ROS) leads to epithelial cell impairment and apoptosis. Once this barrier is weakened, it becomes easier for pathogenic bacteria to invade the mucosa, increasing the risk of inflammation and gastrointestinal diseases. Recent studies have suggested that certain probiotic strains have been found to reinforce cellular antioxidant defenses and limit oxidative damage. Based on this evidence, the present study aimed to isolate novel probiotic strains from kimchi and evaluate their effects on gut health. Initially, Lactiplanticabillus plantarum DSW3805 and Pediococcus pentosaceus DSW4104, both isolated from kimchi were evaluated for gastrointestinal tolerance, adhesion to intestinal epithelial cells using adhesion assays and scanning electron microscopy, and anti-inflammatory activity through nitric oxide assays, quantitative real-time polymerase chain reaction, and western blot analysis in lipopolysaccharide (LPS) treated HT-29 cells. Both strains effectively downregulated pro-inflammatory cytokine expression and modulated nuclear factor kappa B and mitogen activated protein kinase signaling pathways. They also increased the expression of tight junction proteins and supported the regulation of intestinal motility. These findings indicate that L. plantarum DSW3805 and P. pentosaceus DSW4104 have strong potential as probiotic candidates for alleviating intestinal inflammation, strengthening epithelial barrier function, and promoting intestinal function. Secondly, the cytoprotective and antioxidant capacities of three L. plantarum strains (WB3801, WB3804, and WB3808), are isolated from Korean kimchi, against hydrogen peroxide induced oxidative stress in HT-29 cells. The strains demonstrated strong tolerance to acidic and bile conditions and adhered effectively to HT-29 cells, indicating favorable probiotic characteristics. Under oxidative stress conditions, they significantly improved cell viability, reduced intracellular reactive oxygen species (ROS) accumulation, and maintained mitochondrial function. These protective effects were associated with enhanced activation of the Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway, increased expression of antioxidant enzymes such as SOD1 and CAT. Furthermore, flow cytometry and gene expression analyses revealed that strains WB3801 and WB3808 inhibited apoptosis by lowering the Bax/Bcl-2 ratio and suppressing the activation of caspase-9 and caspase-3. These results indicate that WB3801 and WB3808 confer strong antioxidant effect and anti-apoptotic effect through both enzymatic defense mechanisms and direct scavenging of ROS, thereby protecting intestinal epithelial cells from oxidative damage. Their notable cytoprotective capacity supports potential application as functional probiotics for maintaining intestinal homeostasis and preventing oxidative stress related gut disorders. In conclusion, L. plantarum DSW3805 and P. pentosaceus DSW4104 exerted significant anti-inflammatory effects in LPS-stimulated HT-29 cells. Furthermore, L. plantarum strains (WB3801 and WB3808) exhibited potent antioxidative and anti- apoptotic activities in H2O2-induced oxidative stress model using HT-29 cells. Collectively, these findings suggest that isolated strains contribute to the maintenance of intestinal homeostasis, underscoring their potential application as functional food ingredients for the prevention and management of gastrointestinal disorders.

국문 초록 (Abstract)

프로바이오틱스는 숙주의 건강, 특히 위장 건강을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 유익한 미생물이다. 면역 반응을 조절하고, 장 상피의 구조적 완전성을 지원하며, 장 운동성을 향상시키는 데 기여한다. 그러나 위장 항상성은 잘못된 식습관, 심리적 스트레스, 약물 사용 등 다양한 요인에 의해 쉽게 무너질 수 있다. 이 중에서도 산화 스트레스는 장 손상을 유발하는 주요 병리학적 요인 중 하나로 간주된다. 과도한 활성산소종(ROS)의 축적은 상피세포의 손상과 세포자멸사(apoptosis)를 유발할 수 있으며, 장벽이 약화되면 병원성 박테리아가 점막으로 침입하기 쉬워지고, 이로 인해 염증과 소화기 질환의 위험이 증가한다. 최근 연구에 따르면, 특정 프로바이오틱스 균주가 세포의 항산화 방어체계를 강화하고 산화적 손상을 줄이는 데 효과적인 것으로 나타났다. 이에 본 연구에서는 김치에서 신규 프로바이오틱스 균주를 분리하고, 이들이 장 건강에 미치는 효과를 평가하고자 하였다. 첫째, 김치에서 분리한 Lactiplantibacillus plantarum DSW3805 와 Pediococcus pentosaceus DSW4104 를 대상으로 위장관 내 생존력, 장 상피세포와의 부착력(부착 분석 및 주사전자현미경 이용), 항염증 효과를 평가했다. 항염증 활성은 LPS 로 처리한 HT-29 세포에서 NO 측정, RT-PCR, Western blot 분석을 통해 평가되었다. 그 결과, 두 균주는 염증성 사이토카인 발현을 억제하고, NF-κB 및 MAPK 신호전달 경로를 조절하였으며, tight junction 단백질의 발현을 증가시키고 장 운동성 조절에도 도움을 주는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 DSW3805 와 DSW4104 균주가 장 염증을 완화하고 상피 장벽 기능을 강화하며, 장 기능을 촉진하는 데 유망한 프로바이오틱스 후보임을 시사한다. 둘째, 김치에서 분리된 L. plantarum WB3801, WB3804, WB3808 세 균주의 세포 보호 및 항산화 능력을 hydrogen peroxide 로 유도된 산화 스트레스 환경의 HT-29 세포에서 평가하였다. 이들 균주는 산성 및 담즙 환경에서 높은 내성을 보였고, HT-29 세포에 잘 부착되어 프로바이오틱스로서의 특성이 우수함을 나타냈다. 산화 스트레스 조건에서 이들 균주는 세포 생존률을 높이고, 세포 내 ROS 축적을 감소시키며, 미토콘드리아 기능을 유지했다. 이러한 보호 효과는 Keap1/Nrf2/HO1 신호 경로의 활성화와 SOD1, CAT 등의 항산화 효소 발현 증가와 관련이 있었다. 또한 flow cytometry 와 유전자 발현 분석을 통해 WB3801 과 WB3808 은 Bax/Bcl-2 비율을 낮추고, caspase-9 및 caspase-3 의 활성을 억제하여 세포자멸사를 방지함을 확인했다. 이러한 결과는 WB3801 과 WB3808 이 효소적 방어 기전과 ROS 의 직접적 제거를 통해 강력한 항산화 및 항세포자멸 효과를 나타내며, 장 상피세포를 산화 손상으로부터 보호할 수 있음을 보여준다. 이들의 우수한 세포 보호 능력은 산화 스트레스 관련 장 질환 예방 및 장 건강 유지에 기능성 프로바이오틱스로 활용 가능성을 뒷받침한다. 본 연구는 김치에서 분리한 5 개의 분리 균주는 우수한 프로바이오틱 특성을 나타냈다. 그 중 DSW3805 와 DSW4104 균주는 LPS 로 자극된 HT-29 세포 모두에서 항염증 효과를 보였다. 또한, WB3801 과 WB3808 균주는 H2O2 에 의해 유도된 HT-29 세포의 산화 스트레스 모델에서 강력한 항산화 작용과 세포사멸 저해 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 WB 균주들이 염증 억제, 산화 스트레스 완화, 아포토시스 저해를 통해 장 건강을 효과적으로 증진시킬 수 있음을 보여주며, 기능성 식품 소재로서의 활용 가능성을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• List of Tables ⅳ
• List of Figures ⅴ
• Abstract vi
• Chapter 1. Anti-inflammatory effects and improvement of intestinal motility of Lactiplantibacillus plantarum DSW3805 and Pediococcus pentosaceus DSW4104 in HT-29 cells 1
• 1.1. Introduction 1
• 1.2. Materials and methods 4
• 1.2.1. Bacterial strains and sample preparation 4
• 1.2.2. Cell line and culture conditions 4
• 1.2.3. Probiotic properties 5
• 1.2.3.1. Tolerance to artificial gastric juice and bile salts 5
• 1.2.3.2. Adhesion ability to HT-29 cells 5
• 1.2.4. Scanning electron microscopy (SEM) observation of adhered strains 6
• 1.2.5. Inhibition of pathogen adhesion to intestinal cells 6
• 1.2.6. Antibacterial activity of LAB strains against foodborne pathogens 7
• 1.2.7. Safety evaluation 7
• 1.2.7.1. Antibiotic susceptibility 7
• 1.2.7.2. Hemolytic activity 8
• 1.2.8. Cell viability 8
• 1.2.9. Nitric oxide (NO) production 9
• 1.2.10. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 10
• 1.2.11. Western blot analysis 12
• 1.2.12. Statistical analysis 12
• 1.3. Results and discussion 14
• 1.3.1. Probiotic properties of LAB strains 14
• 1.3.2. Inhibition of pathogen adhesion to intestinal cells 18
• 1.3.3. Antibacterial activity of LAB strains against foodborne pathogens 20
• 1.3.4. Antibiotic susceptibility and hemolytic activity 23
• 1.3.5. Cytotoxicity and NO production of the isolated LAB strains 26
• 1.3.6. Relative mRNA expressions related to pro-inflammatory cytokines of the isolated LAB strains 29
• 1.3.7. NF-κB and MAPK signaling pathways of the isolated LAB strains in inflammatory conditions 31
• 1.3.8. Relative mRNA expression related to intestinal motility of the isolated LAB strains 35
• 1.4. Conclusion 38
• Chapter 2. Antioxidant and anti-apoptotic activities of Lactiplantibacillus plantarum WB3801 and Lactiplantibacillus plantarum WB3808 via Keap1/Nrf2/HO-1 pathway in H2O2-induced HT-29 cells 39
• 2.1. Introduction 39
• 2.2. Materials and methods 42
• 2.2.1. Bacterial strains and culture condition 42
• 2.2.2. Cell culture condition 42
• 2.2.3. Probiotic properties 43
• 2.2.3.1. Artificial gastric juice and bile salts tolerance 43
• 2.2.3.2. Adhesion ability to intestinal cells 43
• 2.2.4. Cell viability 44
• 2.2.5. ROS production 45
• 2.2.6. Cell apoptosis analysis 45
• 2.2.7. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 46
• 2.2.8. Western blot analysis 48
• 2.2.9. Statistical analysis 48
• 2.3. Results and discussion 49
• 2.3.1. Gastrointestinal tolerance and cell adherence of LAB strains 49
• 2.3.2. Protective effect of LAB strains on H2O2-induced cytotoxicity 52
• 2.3.3. Reducing effects against H2O2-induced ROS by LAB strains 54
• 2.3.4. Attenuation of H2O2-induced apoptosis in HT-29 cells by LAB strains 56
• 2.3.5. Upregulation of antioxidant genes and downregulation of apoptosis markers by LAB strains 58
• 2.3.6. Activation of Keap1/Nrf2/HO-1 pathway and suppression of apoptosis pathway by LAB strains 62
• 2.4. Conclusion 69
• References 70
• Abstract (in Korean) 81